植物DNA的提取分离技术 摘要：主要介绍了近年来国内外几种常用的 DNA提取方法：CTAB法.SDS法等，并在对其进行了简单的归纳总结与比较分析同时，并介绍 了一些新的改良方法和其他植物提取方法 关键词 ：植物 DNA 提取方法 研究进展市售中药材大多为干品 , 而中药材的加工和贮藏整个过程 , 如日晒、高温烘干等都不利于 DN的完整性，为达到要求目前国内外研究 发现并使用的DNA提取方法有很多1-12，其中被最为广泛应用的 DNA提取方法是传统的CTAB法和SDS法13。由于不同植物的材料 组分和干湿程度各异，因此对不同植物DNA的提取存在着不同的效果。目前许多学者都在致力于研究不同的植物 DNA提取方法。他们在 探索新方法的同时， 也针对不同的植物， 在传统的提取方法上进行着 一些新的改良。1. 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB法在目前众多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最为广泛应用的 一种。它既可以裂解细胞， 又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的 沉淀，因而经常被应用于植物的 DNA提取工作中。1.1 方法及原理CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide, 十六烷基三甲基 溴化铵 ），是一种阳离子去污剂 , 具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与 酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中 （0.7mol/L NaCl）， CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物， 只是不能沉淀核酸。 通过有机溶剂抽提，去除蛋白， 多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出 来。1.2 CTAB 提取缓冲液的经典配方Tris-HCI (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或 Mn2离子，抑制DNase活性；NaCI提供一个高盐环境，使DNP 充分溶解，在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便 于分离。B -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变， 使酚容易去除PVP( 聚乙烯吡咯烷酮 ) 是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的 络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖 结合，有效去除多糖。1.3 适用范围及一些改良由于CTAB提取法能够有效地去除多糖及酚类物质的沉淀，因而 适用于从含酚类及糖类物质较高的植物材料中提取DNA经研究发现CTAB提取法在落羽杉属树木、黑木相思、野生稻、野燕麦、枸杞、 花生的DNA的提取中，相比较其他提取方法来说都是最好的提取方 法。为了缩短提取流程，提高提取质量，研究人员在传统方法的基础 上，针对不同植物的特点， 对一些提取步骤进行了改进。 李先进11 在对四种药用蕨类DNA提取的比较研究中发现，由于酚类物质极其容 易被氧化，因此可以在最开始研磨材料的时候加入4%PV，P 以防止研磨中细胞组织破裂后酚的氧化， 从而获得更为理想的 DNA 黄永莲5 首先将材料在4C放置1 2天，以便于其叶片中的多糖类物质的降 解；然后在用CTAB处理的同时加入蛋白酶 K,提高提取缓冲液中B - 巯基乙醇用量，增加氯仿 / 异戊醇的量和使用次数，以及缩短异丙醇 沉淀 DNA2. 十二烷基磺酸钠(SDS法SDS提取法与CTAB提取法一样，也为常用的 DNA提取方法。在 DNA勺提取过程中，有机溶剂的抽提效果及裂解液的裂解效果都是影 响有机物质去除的先决条件， 不同的有机溶剂和裂解液对于不同种类 的植物DNA提取作用也有所差异。所以有很多植物比较适合使用SDS提取法对其进行DNA的提取。2.1 原理和方法CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide, 十六烷基三甲基 溴化铵) ，是一种阳离子去污剂 , 具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与 酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中 (0.7mol/L NaCl),CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸 . 通过有机溶剂抽 提，去除蛋白、 多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出 来。注：CTAB溶液在低于15C时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰 冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15C。2.2 缓冲液配方2.2.1 CTAB提取缓冲液的经典配方：Tris-HCl (pH8.0) 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或 Mn2离子，抑制 DNase活性；NaCI提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；B -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚 容易去除。2.2.2 CTAB 提取缓冲液的改进配方：(1) PVP( 聚乙烯吡咯烷酮 )是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖 结合，有效去除多糖；(2) 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS异硫氰酸胍 等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化；(3) 多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的5M NaCI,高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提 取缓冲液中加一定量的氯苯 (1/2 体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用， 从而去除多糖。用PEG8OO0弋替乙醇沉淀DNA在500卩L DNA液中 加入 200 卩 l 20% PEG8000 (含 1.2 M NaCl)，冰浴 20min.核酸分离， 纯化；(4) 多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：B -巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力， 可防止酚类与DNA的结合；(5) 盐离子的去除： 70%的乙醇洗涤核酸吸附 , 沉淀和溶解使用合适的 吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一 种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉 淀RNA吸附或沉淀后应用70%勺乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储 存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2或Mn2离子，抑 制DNasepH直为8.0，可防止DNA发生酸解。2.3 适用范围及一些改良在对老芒麦的基因组 DNA分离的研究试验中，SDS提取法是一种 快速、简便、有效的基因组DNAJ、量提取法。另外，在一些研究中还 发现，SDS提取法能替代操作过程较烦琐的大量法提取基因组DNA从而给研究工作带来便利。在毛白杨成熟叶片基因组 DNA提取的研究 中李继东7通过比较发现，SDS提取法是提取出质量高纯度高的 毛白杨成熟叶片DNA的最佳方法，同时发现，如果将PVP添加到裂解 液中，可以大大减少了试验的操作步骤，提取效果同样很好。另外也 有研究发现，SDS高盐介质法又较常规SDS法省去了添加液氮研磨和 水浴加热抽提等操作，可使得 DNA提取试验的操作变得简便快速3. 高盐低pH法运用高盐低pH提取法对植物的DNA进行提取也较为普遍，此方 法所用的试剂仅有无机盐和异丙醇，而醋酸钾又是常用的无机盐试 剂。由于高盐低 pH 提取法没有反复抽提的过程，其所需要的试验材 料也较少，因此比较适合应用于濒临灭绝的濒危物种植物的DNA提取。郝朝运8在对忍冬科部分植物 DNA提取方法的研究中发现， 用高盐低 pH 法能有效地防止组织破碎及沉淀时的电离化作用和酚类 化合物的进一步氧化，避免了采用酚、氯仿等有毒试剂，同时低 pH 的醋酸钾溶液也是有效的蛋白质沉淀剂。 在高盐提取缓冲液中加入一 定量的B -巯基乙醇，则可有效去除木本植物中含量较多的酚类物质， 从而提高提取DNA勺质量。所以该方法尤其适合以一年生或两年生枝 条为材料提取的植物总DNA不但纯度高、产量大，而且所用试剂无 毒、操作简便。最重要的是，本方法所用植物材料（枝条）不受季节 限制，容易获得和保存，具有较高的实际操作意义。4. 植物DNA勺其他提取法4.1 改良尿素法通过大量试验后，曹文波 9研究出了改良尿素法，在原尿素 法基础上在裂解液中添加B -ME、用预冷的无水乙醇取代异丙醇沉淀 核酸、采用水平离心和快速倒出用于洗涤的乙醇等操作。 并从玉米和 水稻叶片中提取出了高质量的基因组 DNA此种方法的DNA产率高、 快速省时、 可在常温下进行操作且成本耗用低。 所以用改良的方法能 够获得纯度高、浓度大的基因组 DNA。4.2优化的植物总DNA提取方法黄萱10 改进了 Clark利用CTAB提取植物基因组DNA勺方法， 在试验过程中， 通过在研磨材料时加入液氮、 用剪去端部的吸头转移 含有DNA勺溶液，并且将加入RNaseA消化RNA勺步骤改在最后进行 等一系列改进，以获得高质量的 DNA郭红媛、佘茂云11对CTAB 法与SDS法进行了总结，研究出了一种适于棉花总 DNA勺提取方法， 得到的DNA满足分子生物学的进一步研究的需要，效果显著。5 讨论关于植物DNA的提取方法虽然前人已经做了大量的研究， 也总结 出很多诸如CTAB法、SDS法、改良尿素法、苯酚法（根据内宫博文 14等的方法加以改进）等适用范围不同的植物DNA提取方法。苯酚 法是DNA的提取中应用较为广泛的方法，其对新鲜样品的提取效果比 较好,但饱和酚容易氧化，平衡时操作较为繁锁。CTAB是一种阳离子 去污剂 , 既能有效的裂解植物细胞壁 , 又能去除多糖类物质。 从本实验 及其他报道来看，其对于许多新鲜植物基因组DNA的提取是较为适用 的,但对干品中药材的DNA的提取纯度不高4。低pH值法中的提取 介质能有效防止组织破碎及沉淀大量材料时电离化作用及酚化合物 进一步氧化15,所得DNA纯度高,产率高,无须进一步纯化，可直接 进行PCRT增。参考文献1Doyle J J,Doyle J L. A rapidDNAisolationprocedureforsmallquantitiesof fresh leaftissueJ.PhytochemBull,1987,19: 11-15.2DellaportaS L, Wood J,Hicks JB. Aplant DNAmini-preparation:version II J.PlantMolBiol Rep,1983(1):19-21.3 Aras S, Duran A, Yenilmez G. Isolation of DNA for RAPDanalysis from dry leaf material of some Hesperis L.Speci-mens J. Plant Mol Biol Rep, 2003,21: 461- 4614 曹 晖,毕培曦,邵鹏柱,等.中药材苦地胆的DNA指纹鉴定J. 中药材, 1996, （12）: 6105 黄永莲，刘媛，黄真池.植物总DNA勺提取方法的改进J. 湛江师范学院学报， 2007， 28，（3）： 25-30.6 袁燕，王德斌，郭丽红.对改良CTAB对蒜头果基因组DNA 提纯效果的影响的研究 J .云南民族大学学报， 2008， 17 ， （ 2）： 143-146.7 李继东，梁启伟，吴文娟.毛白杨成熟叶片基因组DNA提取 方法的比较研究 J. 河南科学， 2009， 27，（3）：285-288.8 郝朝运，刘鹏，郭卫东.忍冬科部分植物DNA提取方法的研 究 J. 浙江师范大学学报（自然科学版） ， 2006， 2（1）：9