Western Blot相关实验方法与试剂（湿转法）人工肝实验室学习姚瑶（一）目的蛋白提取：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉细胞培养液， 加入 Hanks 液洗涤一次后倒掉， 根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约 5ml ）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至 4 支离心管内，配平后， 1500 转离心 10min。2、倒掉上清，用4 度预冷 PBS 溶液洗涤沉淀， 1500 转离心 10min。共洗三次，每次十分钟。3、倒掉上清，吸净，每管加入 50ul 细胞裂解液 RIPA，吹散，加入后由于 DNA 的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至 1.5ml EP管内， -20裂解 30min。4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做）5、 4， 12000 转离心 10min。6、将上清转移至0.5ml EP 管中，每管 100ul，冰浴待用。（2）组织中总蛋白的提取：1、取约 100mg 肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液 RIPA，研磨后吸出于 1.5ml EP 管内，再加入 500ul RIPA，研磨后吸出于上 EP 管内。冰上裂解 30min。2、配平后， 4， 14000 转离心 10min。3、将上清分装于0.5ml EP 管内，每管 100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定：1、稀释标准品： 10ul 标准品 C 液+90ul PBS 溶液，混匀。2、按 0、1、2、4、8、12、16、20ul 将稀释后的标准品加入于 96 孔板内，并用 PBS 将各孔补足 20ul。3、将第 2、3 排 96 孔板分别加入样品 1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用 PBS 将各孔补足 20ul。4、配制工作液：按 A 液：B 液 =50：1 配制适量工作液，每孔加入 200ul。5、37水浴 30min。6、酶标仪测定各孔OD 值（ A570，Mode1）。7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。（三） SDS-PAGE电泳：（ 1）清洗玻璃板（ 2）灌胶与上样：1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。分子量范围凝胶浓度（ %）（ KB ）525-2001010-70155020滤纸 PVDF膜）（五）免疫反应：1 、5%脱脂奶粉封闭， 4过夜。2 、一抗孵育。3 、洗膜： PBST/TBST洗膜 3 次， 10min/ 次。4 、二抗孵育。5 、洗膜： PBST/TBST洗膜 3 次， 10min/ 次。（六）显色：将 HyGLO试剂 A 750ul 与试剂 B 750ul 混合后，均匀地滴于膜正面，约 1min 后，抖掉膜上液体，并吸干后显色。在 Western Blotting 实验过程中使用内参的方法有：一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP 标记内参抗体，按照正常操作即可。二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip 缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker 的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。丽春红染色剂是一种阴离子重氮染料，由重氮氨基偶氮苯二磺酸（diazotized4-amino- 1,1 -azobenzene- 3,4 -disulfonicacid）和萘酚二磺酸（2-naphthol- 3,6-disulfonic acid）耦合到四钠盐上。其分子式 C22H12N4Na4O13S4，分子量为 760.6 。最大吸收光谱为520nm波长。带负电荷的丽春红分子与正电荷的蛋白质氨基基团结合，也可以非共价键形式与蛋白质非极性区域结合。丽春红染色溶液是染料丽春红与蛋白质氨基基团的结合并显示红色蛋白条带，快速、敏感、可逆地检测PVDF膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜上的蛋白成分。丽春红染色溶液性能长期稳定，着色清晰灵敏，可检测250ng 以上的蛋白。丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗去除。使用方法：1取适量丽春红染色液，用去离子水10X稀释备用，染色液的用量，依膜的大小而定，浸没膜即可；2将 PVDF膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染色液中，振荡 5-10 分钟或更长时间；3取出印迹膜，用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3 次，可出现清晰条带，记录结果；4用蒸馏水， PBS或其它适当溶液漂洗 2-3 次，每次 3-5 分钟，去除丽春红，进行后续的 Western 检测。Western Blot相关试剂试剂名称说明Hanks 液细胞漂洗液胰酶提取蛋白PBS 溶液缓冲液、洗涤液细胞裂解液RIPA裂解细胞配制分离胶、浓缩去离子水胶配制分离胶、浓缩聚丙烯酰胺胶Tris-HCl配制分离胶、浓缩胶Tween 20配制分离胶、浓缩胶十二烷基硫酸配制分离胶、浓缩钠（ SDS）胶过硫酰胺配制分离胶、浓缩（AP）胶四甲基乙二胺配制分离胶、浓缩（TEMED ）胶- 巯基乙醇打开蛋白双键上样缓冲液内含溴酚蓝微量加样器加样PVDF膜甲醇活化 PVDF膜，配液封闭液（脱脂封闭蛋白奶粉）PBST/TBST洗涤液HyGLO试剂ECL发光法显色配制电泳液也转膜甘氨酸液检测 PVDF膜上蛋丽春红染色剂白成分蛋白电泳仪WB转膜仪切胶板附 1：溶液配制1、胰酶： 0.25g 胰酶 加 PBS至 100ml。2、30%聚丙烯酰胺：聚丙烯酰胺29g+双丙烯酰胺 1g 见蒸馏水至100ml3、Tris-HCl ：1.5 M：36g Tris加水至200ml加HCL滴定至pH 8.8。1.0 M：24g Tris加水至200ml加HCL滴定至 pH 6.8。4、10% AP：AP 1g加蒸馏水至10ml5、5Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris 15.1g甘氨酸94gSDS5g。使用时稀释成1Tris-甘氨酸电泳缓冲液6、10转膜缓冲液：甘氨酸29g Tris-HCL 58g SDS 3.7g加蒸馏水至1 L 。1转膜缓冲液： 10转膜缓冲液配100ml+甲醇 200ml+蒸馏水至1000ml7、10% SDS：SDS 10g，加入约 80ml 去离子水， 68加热溶解，加去离子水定容至100ml。室温保存。8、TBST 缓冲液： NaCL8.8g1 M Tris-HCl(pH 8.0)20ml加入 800ml 去离