PCR的一般流程（以Taq DNA聚合酶为例）试剂和仪器1. 仪器：PCR仪、移液器、离心管和枪头（121 C灭菌20min , 烘干）、冰盒、板架、离心机。2. ddH2O:三蒸水121 C灭菌20min , 4C保存；3. Buffer :含 Mg+, 10X, -20 C保存；4. dNTP:保存液为25mM使用前用ddHbO稀释为2.5mM并 分装，避免污染，-20 C保存。5. 引物：引物干粉在溶解前先 12,000rpm 离心2min，再 用dd0溶解至10卩M涡旋震荡使其充分溶解，-20 C保 存；6. 模板。7. Taq DNA聚合酶：-20 C保存。实验准备1. 预订PCR仪，填写好使用时间；2. 制冰；3. 将所需试剂解冻、混匀、瞬离，置于冰上，模板要放在冰上解冻。三、步骤：1. 设计实验，认真阅读相关试剂说明书。2. 将离心管置于冰上，按照如下体系加入样品。加样顺序为：ddHS Buffer/dNTP/ 引物 / 模板。TaqDNA聚合酶反应体系（25卩L）试剂用量（卩LddHO18.375 卩 LBuffer(Mg+, 10 x)2.5(1 LdNTP( 2.5mM)2 i L引物（正向和反向，10卩M）各 0.5 i L模板DNA102 105copiesTaqDNA聚合酶*0.125 i L注意：加酶之前将酶拿出放冰上， 使用完立即放回冰箱。3. 在离心管盖上写好每个样品的编号，瞬离。4. 设置好PCR程序，待反应温度达到实验需要时， 将样品 放入PCR仪，尽量放在中央的孔。5. 将试剂放回原处，移液器调回最大量程，整理实验台6. 反应结束后，及时停止 PCR程序（不要停在4C太久）， 取出样品，关好PCR仪。四、 其它注意事项：1. 正确使用移液器、离心机和 PCR仪；2. 手或移液器不要接触反应管或试剂瓶、 管的内壁、 盖内 侧；3. 不使用枪头时，盖好枪头盒盖；4. 枪头只能使用一次；5. 合理设计实验， 使用适当的阴性对照很重要， 如：使用 不加DNA勺材料进行PCRT增，以证明缓冲液或其他试剂中 是否存在任何可影响 PCR的污染物；6. 如果一次实验需做多管样品，尽量先配制 mix ，由于存 在液体混合后勺体积变化和挂液，计算 mix 用量要比实际管 数多一些；7. 反应在PCR仪进行期间，最好能检查一下程序是否在正 常运行，及时发现异常。3.2 移液器勺使用方法1. 调节量程：轻轻旋转量程调节圈，注意不要超过量程。建议从高到低调节量程， 必要时，可旋转量程调节圈稍超过所需数值，再向回旋转，移液可以更准确。2. 装配枪头：轻轻按压，将枪头盒上的枪头装配到移液器。3. 吸液：按下操作键至一档（设定体积），将枪头垂直浸入液体约4mm让操作键慢慢复位，此过程中保持枪头浸入 深度，防止吸入空气；将枪头慢慢移出液面， 并确保枪头 外壁无残留液体。（建议每个新枪头先经过一到三次的吸 液和放液来润湿，有助于提高移液准确度。吸取大体积液 体时，将枪头保持浸入状态约 3秒钟，再移液。）图321 移液器的吸液（A）和放液（B）4. 放液：将枪头倾斜地紧贴管壁， 将操作键慢慢按向一档（设 定体积），等待，直到不再有液体流出；将操作键按向二 档（吹液），将枪头完全排空；仍然按住操作键，在管壁 上擦拭枪头；在管外，慢慢让操作键复位；按下脱卸键卸 掉枪头。5. 其它注意事项：（1 ）轻拿轻放，使用后调回最大量程；（2）保持移液器洁净。（3）与水有很大物理性差异的溶液，或在移液器枪头和液体间存在很大温差的溶液，可能会导致移液不准， 要注意检查移液体积。3.3 PCR反应原理及过程3.3.1 反应原理PCR技术的基本原理类似于 DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，是利用DNA在体外摄氏95。高温时变性会变成单链，低温（经常是60 C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温 度至DNA聚合酶最适反应温度（72 C左右），DNA聚合酶 沿着磷酸到五碳糖（5-3） 的方向合成互补链（图 3.3.1 ）。 基于聚合酶制造的 PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性 温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。3.5.2反应过程PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成（图3.3.2 ）:模板DNA的变性：模板 DNA经加热至95C左右一定时间后，使模板 DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板 DNA经加热变 性成单链后，温度降至55 C左右，引物与模板DNA单链的互 补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以 dNTP为反应原料，靶序列为模 板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模 板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又 可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。精选GcKTPliA f P-JGTP dll P图3.3.1 PCR反应原理Step 1Step 2 Step 325-30 Cyclesf合成 引胸特异 性退火目的DN片段IO5倍扩增112345Time (min)凰示说明|此区域有可能进行引物与模扳的非揣异性退火或引柳之间退火形成引物二8? 饶.追JftDNA的非特异性扩增此时如果便用与抗佈结合的DNAK-ai.ffi &酶活性祥彼抑制.不合反应.可以SfeONAftg菲特异性扩增“，抗体变性.理合画活性恢图332 PCR的基本步骤3.4几种常用PCR方法3.4.1 标准 PCR( Standard PCR )该方法适用于扩增小于3000bp的DNA序列。建议体系：Reaction Volume100 卩 LPrimers0.1-1.0 口 M eachdNTP0.2mM eachSalt6-50mM KCl or (NH 4)2SO4Mg2+1.5-5.0mM MgCl 2 or MgSO4BufferTris-HCl10-50mM,pHTaq Polymerase2-2.5U7.5-9.0Template25102-10 5copies3.4.2 长范围 PCR（ Long and Accurate PCR ，LA PCR）使用混合的聚合酶 （含有一种能校对的聚合酶） 能够增加可扩增产物的大小（5kb 40kb ），因为能去掉错误掺入的核苷酸，而不引起链的终止。Reaction Volume33 LPolymerase Klentaq 1 (a) plus 1/16 Pfu or 1/50Deep Vent (by volume; 1/160 or 1/500 by units)Salt16mM (NH4) 2SO4, no KClMg2+3.5mM MgCl2pH9.2Buffer50mM TrisTemplateCyclesExtension TempExtension Time later cycles)2ng lambda DNA2068 C11-24min (longer at但也可3.4.3 热启动 PCR( Hot Start PCR )热启动PCR是提高产量和特异性的一种简单方法，能会造成重复性和污染等问题。室温下加样，可能会导致引物和模板的非特异性结合。在PCR的最初几个循环里，通过变性可以防止这些非特异性 结合产物的延伸。热启动 PCR则通过控制一种 PCR成分的加 样时间，来提高扩增的特异性。通常，直到反应温度到达引 物最适退火温度以上时， 再加入这种关键成分， 如引物、 酶、 Mg+或 dNTP热启动温度随推迟反应的方式而改变。推迟PCR反应有几种方式。最简单的一种是，在反应管 达到第一个循环的 DNA熔解温度之前，不要将 DNA聚合酶加 到反应管内。当处理少量样品时，这种方法可以得到令人满意的效果；但当处理大量样品时，则效果不佳。一种更方便 的方法是，使一种组分在达到一个适当的温度之前处于无效 状态。例如，把聚合酶或镁盐掺入到蜡珠内便可做到这一点， 这些珠子在适当的温度熔化，能够使反应开始。另一种方法 是，在开始时，用一种抗体与聚合酶形成复合物，使聚合酶 灭活，在高温下抗体变性，能够使聚合酶发挥功能。如果在 热启动PCR中使用修饰过的酶，则需要向典型的PCR反应中加一预热步骤，预热温度可以在 92-100 C之间，时间为2-20 分钟，有助于消除在较低温度时引物和模板结合形成的非特 异产物。热启动PCR可以与其它PCR方法（如touchdown PCR） 结合使用。3.4.4 温度递降 PCR（ Touchdown PCR）Touchdown PCR最初用来简化确定最适退火温度的过程。 最初使用一个高的退火温度（在此温度下，即使正确的结合 可能也无法进行） ，在随后几轮，降低退火温度，当降到某 一个温度点时，只有正确匹配的引物 - 模板能够退火，而不 正确的匹配则不能够退火，因此DNA合成能够开始。尽管后来的循环可能会在不是最严谨的条件下进行，但早期的循环 已在最严谨的条件下进行，想要的目标产物将是最丰富的。通常，第一个循环的退火温度设置为高于理论Tm 15 C,在接下来的循环里，每循环降低 1-2 C,直到低于Tm5C左右。345 嵌套 PCR（巢式 PCR Nested PCR）在这种PCR中，进行两次连续的 PCR第一次PCR使用 常规的模板，然后用第一次 PCF反应的产物（通常要稀释适 当倍数）作为第二次 PCR的模板，将第二次 PCR的引物设计 成能够与第一次 PCR目标产物的序列退火。虽然第一次PCR除了能产生目标产物外，可能还会产生一些非特异性的产 物，但非特异性的产物几乎不可能也包含第二次PCR所用引物的两个位点。因此，只有第一次PCR的目标产物才可能是第二次PCR的合适模板。3.5 PCR 可变因素PCR的各种因素相互影响，相互制约，很难同时提高PCR 的特异性、产量和保真度。3.5.1 引物（ Primers ）标准用量：0.1-1.0卩M。多数情况下，0.2-0.5卩M就能 满足需要。提高特异性：1、降低引物和dNTP的浓度可以显著提高 特异性。高浓度会导致非特异结合、引物二聚体的形成。2、在适当范围内，降低引物 / 模板的比例。提高产量：提高引物 / 模板的比例。如果有过剩的引物， 需要降低引物浓度。3.5.2 聚合酶( Polymerases )标准用量：1-5Units/卩L。(不同供货商对“ Unit ”的 定义会有差别。 )提高特异性：在适当范围内，降低聚合酶浓度。聚合酶 浓度是决定PCR严