ICS65.150B 51DB21辽宁省地方标准 DB21/T XXXXXXXXX水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA分子标记法Technical specification for species molecular identification using COI and 16S rRNA of aquatic animals报批稿XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施辽宁省市场监督管理局发布DB21/T XXXXXXXXX前言本标准依据GB/T 1.12009给出的规则制定。本标准由大连市质量技术监督局提出。本标准由辽宁省农业农村厅归口。本标准主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本标准主要起草人：高磊、赫崇波、鲍相渤、高祥刚。附录A、B、C为资料性附录。1水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA分子标记法1 范围本方法规定了水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA分子标记法的相关术语和定义，标记方式，试剂、仪器和设备，样品采集、保存和前处理，DNA提取和检测，序列扩增和测序，以及物种鉴定的方法。本方法适用于水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA分子标记法。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1水产动物物种分子鉴定 aquatic species molecular identification指利用分子生物学手段,对水产动物样本（尤其适用于形态学特征相近、模糊或丢失的样本）的分子标记进行分析，鉴定生物种类的过程。3.2聚合酶链式反应 polymerase chain reaction（PCR）用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异DNA片段的过程。3.3DNA序列测定 DNA sequencing测定DNA分子的核苷酸序列。3.4序列比对 alignment为确定两个或多个序列之间的相似性和同源性，将他们按照一定的规律进行排列。3.5DNA条形码-COI细胞色素c氧化酶亚基I（cytochrome c coxidase subunit I）。3.616S rRNA16S核糖体核糖核酸（16S ribosomal RNA）。4 标记方式水产动物的COI和16S rRNA的DNA序列进化速度较快，同时又相对保守，可作为分子标记条形码用于物种鉴定。通过PCR技术扩增水产动物的COI和16S rRNA基因部分序列，测序后在已知数据库中进行序列比对，确定物种分类信息。本方法同时对COI和16S rRNA两种分子标记条形码进行分析，并在GenBank（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）和BOLD System（http:/www.boldsystems.org）两个数据库中比对，确保鉴定成功率和准确率。5 试剂、仪器和设备5.1 试剂实验仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T 6682一级水要求。主要包含以下内容： 无水乙醇； 95%乙醇； TE缓冲液（pH7.6）（100mol/LTris-Cl，pH7.6；10 mmol/LEDTA，pH 8.0）； Taq酶（5U/L）； 超纯水； 10PCR缓冲液（500 mmol/L KCl；100mmol/LTris-Cl，pH 8.3；15mmol/L MgCl2）； 引物（10mol/L）； dNTP混合液（每种脱氧核糖核苷三磷酸浓度2.5 mmol/L）； 溴化乙锭（10mg/mL）； 琼脂糖； 电泳标记物（markers）； 平衡酚； 氯仿/异戊醇（24:1）； 10Tris硼酸（10TBE）电泳缓冲液； 灭菌蒸馏水； 液氮； 细胞裂解液（20 mmol/L）。5.2 仪器和设备实验用仪器和设备主要包含以下内容： 凝胶成像分析系统； PCR仪； 低温高速离心机（4，12000转）； 稳压稳流电泳仪； 单道可调移液器； 电子天平（0.001g）； 水浴恒温震荡器； 电泳槽； 紫外分光光度计； 遗传分析仪。6 样品采集、保存和前处理6.1 样品采集、保存样本采集和后续实验应在生物安全实验室进行。选择DNA含量高、多糖等含量低的肌肉、肠道、体腔液、鱼鳍等组织进行采样，样品可通过-20冷冻、或4冰鲜等方式暂时保存。6.2 样品前处理将样品切成5mm左右直径的小块或薄片，用灭菌蒸馏水洗净，按1:10左右比例将样品放入盛有95%乙醇的离心管中，4保存。7 DNA提取和检测7.1 DNA提取7.1.1 取0.1g左右样品置于陶瓷研钵中，加少许液氮研碎。将粉末转入400L500L细胞裂解液离心管中，37温浴1h后转入50水浴3h，期间经常摇动。7.1.2 反应液冷却后加500L平衡酚，缓慢颠倒10min混匀。12000rpm离心15min，转上层水相于新离心管中（重复此过程一次）。7.1.3 加氯仿/异戊醇450L，混匀后12000rpm离心10min。转上层水相于新离心管中，加1/10体积3mol/LNaAc和2.5倍体积无水乙醇，混匀，置于-20环境下1h。7.1.4 12000rpm离心15min，弃上清。以70%冷乙醇洗涤12次，真空抽干或自然吹干，加入TE缓冲液溶解，-20保存。7.2 DNA检测7.2.1 纯度检测吸取1L3LDNA，琼脂糖凝胶100V电泳30min，如条带整齐、亮度高，则纯度满足实验要求。7.2.2 浓度检测分别于260nm和280nm波长下测定DNA的紫外吸收值。DNA浓度(g/mL)=A260/(0.020L)稀释倍数，式中L为比色池厚度，单位cm。DNA浓度在10g/mL以上时进行后续实验。8 序列扩增和测序8.1 引物水产动物PCR扩增引物参见附录A。8.2 PCR扩增PCR扩增应在以下体系和条件下进行： PCR扩增体系：10PCR缓冲液10L、上下游引物各1L、DNA提取液5L、Taq酶0.5L，dNTP混合液8L、超纯水定容至50L； PCR扩增条件：一个循环反应（955min），30个循环反应（9430s，50 30s，7260s），72 10min，结束PCR反应。8.3 测序利用遗传分析仪对PCR产物进行双向测序，得到DNA序列信息。9 物种鉴定9.1 序列比对鉴定将COI基因序列在GenBank和BOLD System中进行核苷酸序列比对，将16S rRNA基因序列在GenBank中进行核苷酸序列比对。比对结果认定如下： 序列比对检出标准为序列相似度99%； 综合COI和16S rRNA的比对结果形成最终鉴定结果； 若出现2个及以上比对结果，则选取相似度高且结果一致的鉴定物种作为鉴定结果； 对于鉴定成功的样本，记录于水产动物物种分子鉴定记录表（见附录B）； 对于无匹配结果，或结果矛盾的样本，作为未检出样本处理。9.2 未检出样本未检出样本记录于未检出水产动物分类记录表（详见附录C）。AA附录A （资料性附录）水产动物物种分子鉴定PCR扩增引物表A.1 水产动物物种分子鉴定PCR扩增引物物种引物序列COI基因PCR扩增引物硬骨鱼纲软骨鱼纲F: 5-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3R: 5-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3甲壳纲F: 5-TATTATTAGACAAGAATCTGGTAAA-3R: 5-AGGAAATGTTGAGGGAAGAAAGTAA-3双壳纲腹足纲F: 5-ACAAATCAYAARGAYATYGG-3R: 5-ACCAATCATAAAGATATTGG-3头足纲F: 5-ACAAAYCATAAAGAYATTGG-3R: 5-GTAAATATATGRTGGGCTCA-3海参纲海胆纲海星纲F: 5-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3R: 5-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3钵水母纲F: 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC-3R: 5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3哺乳纲F: 5-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3R: 5-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3爬行纲F: 5-ACTCAGCCATCTTACCTGTGATT-3R: 5-TGGTGGGCTCATACAATAAAGC-3通用（选用）F: 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3R: 5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-316S rRNA基因PCR扩增引物通用（除甲壳纲和头足纲）F: 5-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3R: 5-TCCATAGGGTCTTCTCGTC-3甲壳纲F: 5-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3R: 5-TCCATAGGGTCTTATCGTC-3头足纲F: 5-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3R: 5-TCCATAGGGTCTTTTCGTC-3注： COI基因PCR扩增引物可选用特异引物或通用引物。BB附录B （资料性附录）水产动物物种分子鉴定记录表表B.1 水产动物物种分子鉴定记录表鉴定人 ；地点 ；时间 年 月 日 时 分至 年 月 日 时 分序号样本编号样品名称样品来源鉴定结果备注12345678910记事：采样人 记录人 校对人CC附录C