动物胚胎移植技术 摘 要胚胎移植又称受精卵移植，是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内冲洗出来，移植到另一头雌性动物的输卵管或是子宫内，使之继续发育成新个体的技术。动物胚胎移植主要是通过对优良供体母畜作同期排卵处理和体内胚胎生产或体外人工授精（IVF）的方法，以大量获得优良的动物胚胎后再将其移植给普通代孕受体母牛进行快速繁殖优良动物的生物技术。胚胎移植技术主要用于快速扩大优秀种公牛和核心母牛的数量。尽管单个胚胎的生产成本较高，但由于种公牛和种母牛较高的经济价值和社会价值，以及利用胚胎移植在育种方面可以获得同胞或同卵双生牛进行后裔测定等优势，因此，该技术在种公牛的选育和优质核心母牛群的培育以及加快育种步伐方面均具有极大的优越性。 本论文将对动物胚胎技术作比较全面的阐述，使大家对动物胚胎技术有一个比较全面的认识。关键词： 供受体 超数排卵 同期发情 胚胎回收 胚胎检查 胚胎移植1 动物胚胎移植的生理学基础1.1 发情后生殖器官的孕向发育 家畜在发情后生殖器官会发生一系列变化，如：卵巢中功能性黄体的形成，孕酮的分泌和维持，子宫内膜组织的增生和分泌机能的增强，以及其他生理生化的特异现象。这些变化都为胚胎的生存和发育创造了适宜的条件，为妊娠作准备。 配种受孕后的动物其生殖系统朝着妊娠的方向继续发生变化以适应胚胎发育的需要，如黄体的持续存在以及孕酮的分泌和维持，子宫内膜的继续发育。而未受孕的动物其生殖系统会退回到发情前状态。 发情供体和受体发情周期的同期化程度前后不超过一天，否则移植成功率就会降低，甚至移植失败 因此发情后或交配刺激后雌性动物生殖器官的孕向变化是进行胚胎移植的主要生理学基础。1.2 早期胚胎的游离状态胚胎在发育的早期有相当一段时间是游离存在于子宫内的，和子宫黏膜没有建立紧密联系，其发育主要靠自身贮存的养分。这样，早期的胚胎容易从生殖道中取出，而且在离体情况下，可短期培养，易存活。 早期胚胎处于游离状态是能够进行胚胎移植技术的基础 1.3 子宫对早期胚胎的免疫耐受性1.4 胚胎遗传物质的稳定性在同一物种之内进行胚胎移植不会产生排斥现象;同时，受体对胚胎不产生遗传上的影响，不会改变新个体的遗传特性，也不会减弱起优良性状在出生后的表现程度。2 动物胚胎移植技术的程序2.1 供受体的选择与管理2.1.1 供体的选择 遗传学价值 在畜牧生产中，应选择生产性能优秀的母兽作为供体 健康状况 应选择身体健康，营养水平中等以上未受孕动物作为供体 繁殖性能 供体应是达到配种年龄以上繁殖机能正常的母畜2.1.2 受体的选择 身体健康 繁殖状况正常 母性良好 包括泌乳性能和护仔能力等 2.1.3 供受体的管理在供受体选择时，可根据情况进行传染病的检疫，预防注射和驱虫等工作，确保在胚胎移植过程中供受体的健康;观察供受体发情周期，以便超排和同期发情程序的选择和安排；每日供给中等以上营养水平，注意青绿饲料，维生素和微量元素的补充；2.2 超数排卵处理在雌性动物发情周期中的适当时间注射促性腺激素，使卵巢上有比自然生理状态下更多的卵泡发育并排卵，这种方法称为超数排卵。 其目的是增加有活力卵子的数量，并获得较多的可移植胚胎。 目前，用于超排的促性腺激素主要是促卵泡素（FSH）和孕马血清促性腺激素（PMSG）。 FSH半衰期短，用于超排时需要多次注射，而PMSG半衰期长，会产生后效应，导致 发情期延长，影响超排效果和胚胎质量，结合注射PMSG抗血清，可消除半衰期过长的副作用。 2.3 同期发情2.3.1 同期发情的定义利用某些激素制剂处理,人为地控制并调整一群雌性动物发情周期之间同期化的方法,称同期发情.胚胎移植时,受体必须和供体处于相同的发情阶段,才能获得较高的成功率.在发情周期的不同阶段,生殖器官的内分泌环境,生化和组织学特性,对不同发育阶段的胚胎有不同的影响,胚胎要移植到和供体处于相同发情周期阶段的受体生殖道的适当部位,才能继续发育.2.3.2 同期发情的原理同期发情主要借助外源激素刺激卵巢.使之按预定的要求发生变化,使处理母畜的卵巢生理机能处于相同阶段.通常采用两种途径:一种时延长黄体期,给一群母畜同时使用孕激素药物,抑制卵泡的生长发育和动物的发情表现.经过一定时期后同时停药,由于卵巢同时失去外源性孕激素的控制,且卵巢上的周期黄体已退化,于是同时出项卵泡发育,引起母畜发情采用孕激素移植母畜发情,实际上是认为地延长黄体期,起到延长发情周期,推迟发情地作用.另一种途径是缩短黄体期,应用前列腺素促使黄体退化,使卵巢提前摆脱内源性激素地控制,于是卵泡得以同同时开始发育从而达到母畜同期发情.这种情况实际上是缩短母畜地发情周期,促使母畜在短时间内发情。2.3.3 同期发情的药物及其使用方法2.3.3.1 抑制卵泡发育的制剂这一类药物主要是孕激素类,包括孕酮,甲孕酮,氟孕酮,甲地孕酮和18-甲基炔诺酮等.他们能够抑制垂体促卵泡素的分泌,延长黄体期,因而间接地抑制卵泡发育和成熟,是母畜不发情.其用药方法有:u 阴道栓塞法:将孕酮阴道栓或自制浸吸一定量药剂的阴道海绵塞放置于阴道前端,药液不断被阴道黏膜吸收,经过一定时间后取出,此法常用于牛和羊u 埋植法:将成形的药剂或装有药物的带孔容器埋植于母畜皮下组织,药物被缓慢吸收,经过一丝那个时间后取出,此法可用作群体处理.u 注射法:每日将定量药物作皮下或肌肉注射,经过一定时间后停药.此法剂量准确,但操作麻烦.u 口服法:每日将一定量的药物均匀拌在饲料中,以单个饲喂较为准确,经过一定时间后停药.这种方法可用于舍饲母畜.但较费时费工,群体饲喂还会造成个体剂量不准确.2.3.3.2 溶解黄体的制剂主要是前列腺素及其类似物,如15-甲基PGF2,氯前列烯醇,氯胎素等.它们具有明显的溶解黄体作用,因此用于正处于黄体期的母畜的同期发情,对卵巢上没有黄体的动物无效.牛和羊的发情周期的716d以内的黄体对前列腺素都易产生反应,采用子宫内灌注效果优于肌肉注射.经前列腺素处理后24d,母畜发现发情,未发情的间隔1020d进行第二次注射,在此期间,可能自然发情形成黄体,对第二次注射作出应答反应.此法方便可靠,但费用高。2.3.3.3 促进卵泡发育,排卵的药剂主要有FSH,LG,PMSG,hCG和GnRH等及其类似物的那个,一般在应用上述;两类激素的基础上配合使用,以增强发情同期化,并使卵泡更好地成熟和排卵.2.4 胚胎回收2.4.1 胚胎回收的定义胚胎回收也称采卵或采胚,就是利用冲胚液把胚胎从供体生殖道中冲洗出来,提供移植或其他胚胎工程应用.2.4.2 胚胎回收地时间胚胎回收地时间,可根据所需胚胎地发育阶段来确定.动物种类不同,其胚胎早期地发育速度有所差异.以配种后计算,几种动物的早期胚胎发育进程近似值见表2.4.3 冲胚液的配制冲胚液和胚胎的短期培养液通常是用改良的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)根据配方要求分别制备I,II,III液,三蒸水加至最终量的80%,在冰箱中冷却至4 ,依次混合后用容量瓶定容至1000mL,注意防止沉淀,PH应为7.17.2,如不符,可用NaHCO3或HCL调节,渗透压为310mOsm.配好后,用孔径0.45um滤器过滤除菌,分装密封(注意无菌操作),标记,4冰箱保存34月.临用前加入灭活小牛血清,一般冲胚液加10%20%,也可在定容时加入血清,然后再过滤分装.2.4.4 采胚方法根据动物种类和胚胎的发育阶段,胚胎回收可采用手术法和非手术法2.4.4.1 手术法就是对供体进行常规腹部手术将生殖道部分移出腹腔,用冲胚液对输卵管或子宫角进行冲洗,回收胚胎.本法适用于羊,猪和兔等中小动物;在牛中,如需回收进入子宫前的早期胚胎,仍需用此法.按外科手术常规方法打开腹腔,先把一侧子宫角,输卵管和卵巢牵引至腹壁切口之外,检查卵巢反应情况(黄体数,残留卵泡的大小,数目及排卵情况)并进行记录.冲胚的方法包括输卵管冲胚法和子宫角冲胚法2.4.4.1.1 输卵管冲胚法用冲胚液冲洗输卵管腔,回收进入子宫前的胚胎,分上行法和下行法.上行法时从子宫角的前端刺入注射针,向上冲洗输卵管,注意用手指固定针头并提捏住子宫角,防止冲洗液从进针周围流出后流向子宫体方向.冲洗液通过从输卵管伞插入到壶腹部的玻璃细管或硅胶管等回收到平皿或试管内;下行法时通过从伞部插入到壶腹的玻璃细管或硅胶管等注入冲胚液,向子宫方向冲洗,冲洗液通过插入到子宫角上部的带有充气囊的二路式导管或回收针回收.一侧冲洗完毕后,还纳腹腔,在冲另一侧.2.4.4.1.2 子宫角冲胚法冲洗子宫角,回收进入子宫角的胚胎.依据动物子宫角的大小,选用长45cm,外径1.21.4mm的针头,改制一个回收针.将回收针插入子宫腔,用套有乳胶管的肠钳夹住子宫角和针体.将宫管结合部之前的输卵管用血管夹夹住,以免冲胚液流入输卵管.然后从宫管结合部后端的胶管收集冲出液于平皿或试管内.一侧冲洗完毕后,除去器械,确认针孔无出血后,还纳腹腔,然后冲另一侧.冲胚完毕后,把生殖器官还纳腹腔,向腹腔注入防粘连剂和抗生素. 按常规腹部手术方法闭合手术通路,进行常规术后护理. 手术法采胚,冲胚液用量少,胚胎回收率高,但由于手术对动物有一定的损伤,手术不当或多次手术,易引起生殖器官粘连,导致供体不孕.2.4.4.2 非手术法是在胚胎进入子宫角后,用冲胚器具通过子宫角冲洗采集胚胎的方法.可以不做手术而采胚,不仅减小了手术对供体的危害,节约时间,降低成本,而且可以重复采胚.本法主要用于牛,马等大家畜.回收方法: 先要去除子宫颈黏液,术者一手在直肠内握住子宫颈,一手持子宫颈黏液去除器插入子宫颈,由助手抽吸除去子宫颈黏液.如插入困难,可用子宫颈扩张棒扩张子宫颈,除去子宫颈黏液后,送入两路或三路冲胚管.冲胚管前端插入子宫角前1/3后，给气囊充气。通过冲胚管的进液管向子宫内注入冲胚液.当液体注入使子宫角膨大到相当于妊娠4060d时，一般2040ml，如使用三路冲胚管，可打开除夜管，并按摩子宫，时胚胎从子宫皱壁中游离出来，随液体流出，收集在量筒活集卵胚等容器内。反复冲洗，每侧用液300500ml。冲洗完毕，向子宫内注入青霉素100万IU，链霉素1.0g。回收的冲胚液，在室温下静置30min，用吸管除去上部液体，将下部回收液放入大检卵杯活平皿中检出胚胎，也可用集卵杯过滤冲胚液，剩下适量用于检胚。2.5 胚胎检查2.5.1 胚胎检查的定义胚检是从回收液中，将受精卵活胚胎检出，并进行必要的净化处理，同时对检得的胚胎进行形态学鉴定，确定其品质，把符合移植的胚胎暂时保存于新鲜培养基中，准备移植或保存。2.5.2 胚胎的发育受精后，卵细胞是按2，4，8.细胞顺序相继分裂，到16细胞为止，可通过显微镜观察来计算分裂球的数目。16细胞以后，分裂球难以计算，形成的细胞团呈桑椹状，故称为桑椹胚。桑椹胚进一步发育，在细胞团中出现小腔，形成囊胚状，这时的胚胎叫囊胚。囊胚逐渐扩张其腔，不久从透明带中脱出（即孵化）。正常的胚胎透明带应是圆形，有弹性，厚度随着胚胎的发育而变化，胚