粮油检验 谷物中黄曲霉毒素B1的测定 时间分辨荧光免疫层析定量法标准编制说明黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是一类由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，是最为常见的真菌毒素之一1-3，已知的黄曲霉毒素约20多种，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）最为常见且毒性最强，具有强致癌和致突变性，毒性是砒霜的38倍，是迄今为止已知毒性最强的物质之一，被国际癌症研究机构列为类致癌物。农产品中黄曲霉毒素污染范围广、环节多、管控难，随着气候变暖和农业耕作方式的变化，中国农产品受黄曲霉毒素污染呈加重趋势，成为威胁农产品生产、消费者安全与国际贸易的重要风险隐患。国内外非常重视黄曲霉毒素的防控，为控制黄曲霉毒素的污染，我国在2005年颁布了粮食和食品中黄曲霉毒素B1（AFB1）的限量标准，2017年最新颁布的国家食品安全标准食品中真菌毒素限量规定了玉米、玉米面（渣、片）及玉米制品中AFB1的最高限量为20 g/kg，稻谷、糙米、大米中AFB1的最高限量为10g/kg，小麦、大麦、麦片、小麦粉、其它谷物及去壳谷物AFB1的最高限量为5 g/kg4。目前，国标（GB）规定的谷物中黄曲霉毒素B1的检测方法有同位素稀释液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-柱前衍生法、高效液相色谱-柱后衍生法、酶联免疫吸附筛查法和薄层色谱法。粮食行业标准（LS/T）规定的黄曲霉毒素B1的检测方法有胶体金快速定量法。液相法或质谱法处理过程复杂，需要大型精密仪器和专业人员操作，费时、费力、费钱；薄层色谱法前处理过程复杂，费时费力；ELISA法和胶体金免疫层析法稳定性相对较差，批间差大，均不能很好满足快速检测的要求。基层检测单位迫切需要方便、准确、快速和低成本，可实现大量样本快速筛查的黄曲霉毒素B1检测方法，以满足农产品生产过程监控、现场监督、检查的工作需要。时间分辨荧光免疫层析定量法能很好地满足上述要求。时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是20世纪80年代中期发展起来的一种新型非放射性免疫标记技术，利用免疫反应的高度特异性和标记示踪物的高度灵敏性相结合而建立的一类微量物质检测技术，其灵敏度、可测范围和稳定性都优于现有的酶联免疫分析法和胶体金法，具有广阔的应用前景。本标准旨在建立谷物中黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光免疫层析检测技术，用于谷物中黄曲霉毒素 B1的快速、准确定量检测。便于基层粮库、粮油企业以及粮食监管部门中对谷物中黄曲霉毒素B1的准确定量和检测，实现对谷物中黄曲霉毒素B1的有效监管。保障粮食的质量安全和人民群众的身体健康，最终实现我国农业等行业的健康发展。1工作简况1.1任务来源及起草单位根据国家粮食局办公室关于下达2017年第三批粮油行业标准制修订计划的通知（国粮办发2017297号）的要求，由国家粮食局科学研究院负责粮油检验 谷物中黄曲霉毒素B1的测定 时间分辨荧光免疫层析定量法起草工作。起草单位成立标准起草组进行本标准制定的各项工作。1.2标准研制主要工作过程（1）根据该标准的特点，2017年11月-2017年12月，查询了国内外资料，对相关检测机构、粮库、粮食加工企业进行了调研，并召开了第一次标准起草讨论会，确定了标准制订方案和工作计划。（2）2018年1月-2018年3月，在国家粮食局科学研究院实验室进行标准的研制工作，主要包括方法的建立，方法灵敏度测试，方法的线性范围确定，方法的回收率研究等。（3）2018年3月，编写了粮油检验 谷物中黄曲霉毒素B1的测定 时间分辨荧光免疫层析定量法标准草案及编制说明。（4）2018年3月-2018年7月，组织实验室间方法验证。验证结果处理统计，并形成标准编制说明草案。 （5）2018年7月，召开了第二次讨论会，形成标准和编制说明的征求意见稿，进行意见征询。2标准的编制原则和标准的主要内容2.1标准编制原则本标准是根据GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构与编写规则、GB/T20001.4-2015标准编写规则第4部分：化学分析方法的规定进行编制的。2.2确定标准主要内容2.2.1 标准的适用范围本标准规定了时间分辨荧光免疫层析定量法测定谷物中黄曲霉毒素B1的原理、试剂及材料、仪器及设备、样品制备、样品测定、结果表述、重复性。本标准适用于糙米、玉米和小麦等谷物中黄曲霉毒素B1的快速检测。本标准的方法检出限为0.7 g/kg，定量限为2g/kg。2.2.2 标准研制的总体思路2.2.2.1 最佳反应时间优化将5 ul/ml喷涂量荧光微球标记物组装大板，切4mm宽的试剂条分别取100L AFB1 浓度为 0、0.35、0.7、1.4、3.5、7、14、35ng/m L标准液体加入试纸条加样孔，10min 后用荧光读取仪检测试纸条 T、C 线荧光强度，跟踪记录 45 min 内试纸条 FIT、FIC和 FIT/FIC 值变化，具体结果见下图 ，从插图 中可知，AFB1 浓度为 0 pg/m L时，随着反应时间的增长，试纸条 T、C 线荧光强度逐渐增加，直到 45 min 后，T、C 线免疫学反应仍然没有进入稳定状态；而从图可知试纸条 FIT/FIC 比值在反应 10 min 进入了稳定状态，且随着 AFB1 加标浓度的增加，FIT/FIC 越快进入稳定状态。以上实验结果表明，以 FIT/FIC 值为基础的试纸条定量检测模型一定程度上可消除试纸条外界环境的干扰，缩短检测时间。本实验最后确定试纸条定量分析的判读时间为加样后 10 min。图 1最佳反应时间优化2.2.2.2溶液 p H 对试纸条的影响分别调节阴性混合样品至 p H 5、6、7、8 和 9，评价溶液 p H 对试纸条 FIT、FIC 和 FIT/FIC 的影响。从图中可以看出，当检测溶液 p H 为 59 时，试纸条的竞争抑制率处于 37.52%和 41.16%之间，数值变化不明显；当样品 p H 从 5 增至 7 时，T 线荧光强度明显上升，而当 p H 为 79 时，FIT 值处于相对稳定的状态位于 971.45 和 1088.88 之间。因此为了获得 T 线上较强的荧光检测信号，本实验选用 0.01M，p H 7.4 的 PBS 的溶液作为后续实验的检测溶液。图2溶液 p H 对试纸条的影响2.2.2.3溶液甲醇浓度对试纸条的影响黄曲霉毒素 B1 难溶于水，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，其中甲醇对免疫反应影响最小。为了探究溶液甲醇浓度对免疫层析试纸条检测的影响，分别将阴性玉米混合样品调节甲醇浓度至0、5、10、20、30 和 40%，评价待检样品中甲醇对试纸条 FIT、FIC 和 FIT/FIC 的影响，具体实验结果见图 2.14。从图中可知，当样品中甲醇浓度在小于 40%时，试纸条的 FIT、FIC、FIT/FIC 以及竞争抑制率，与不含甲醇时值相差不大；而随着溶液中甲醇浓度的增加，竞争抑制率随着甲醇浓度的增加而降低。实验结果表明当溶液中甲醇浓度低于 40%时，对试纸条的检测结果影响不大，本实验选用小于30%甲醇溶液。图3溶液甲醇浓度对试纸条的影响2.2.2.4 AFB1 荧光微球试纸条定量检测标准曲线的建立取黄曲霉毒素 B1 标品加入阴性混合玉米样液配制 AFB1 浓度分别为 0、0.35、0.7、1.4、3.5、7、14、35ng/m L 的标准溶液用于荧光试纸条检测，每个浓度测定五个平行，10 min 后用荧光读取仪记录试纸条 FIT、FIC 以及 FIT/FIC 比值。设定浓度为 0 标准液的 FIT/FIC 比值为 B0，其他加标浓度的 FIT/FIC 比值为 B，以 B/B0100（%）为纵坐标，黄曲霉毒素 B1 浓度为横坐标做图，绘制试纸条竞争抑制曲线，竞争抑制率设为(1-B/B0) 100%，结果见图4。从图可知，随着黄曲霉毒素 B1 浓度的增加，B/B0100（%）逐渐降低，竞争抑制率渐增大，且当黄曲霉毒素B1 浓度为 0.05g/m L 7ng/m L，具有很好的线性关系，根据线性回归方程得出试纸条的 IC50为 小于0.5ng/ml。下图是黄曲霉毒素 B1 浓度分别为 0、0.35、0.7、1.4、3.5 和 7 pg/m L 紫外灯下观察到的量子点荧光微球试纸条实体图，从图中可以看出，随着黄曲霉毒素 B1 浓度增加，T 线荧光强度逐渐减弱，符合免疫学竞争反应规律。图4 AFB1 荧光微球试纸条定量检测标准曲线的建立2.2.2.5方法检出限和定量限检出限与定量限：随机挑选一台设备测定20次阴性样品；检出限（LOD）：采用20个阴性样品（或一个阴性样本20次检测）检测值的均值，加上3倍标准偏差计算；检出限（LOQ）：采用20个阴性样品（或一个阴性样本20次检测）检测值的均值，加上10倍标准偏差计算； AFB1方法检出限和定量限 单位：g/kg测定次数测定值平均值标准偏差检出限定量限100.0840.2020.72.120304050.32756070.114180.745490100110120130140150160170180190200.49262.2.2.5方法的准确度和精密度采用本方法对添加AFB1的阴性小麦、玉米和糙米样品进行检测。小麦中AFB1的添加量分别为2.5ng/g，5ng/g和10ng/g等3 水平，玉米中AFB1的添加量分别为10ng/g，20ng/g和30ng/g等3 水平，糙米中AFB1的添加量分别为5ng/g，10ng/g和20ng/g等3水平，每个加标水平进行6 次重复实验。3种基质的3 个添加水平回收率在91.4%109.1%之间；变异系数小于10%。回收率和变异系数均符合GB/T 274042008实验室质量控制规范 食品理化检测，说明本方法具有较好的具有较好的准确度和精密度。2.2.2.6实际样品的分析应用建立的方法与现行国家标准高效液相色谱法进行比较。应用本本建立的方法分析了来自不同粮食产区的稻谷、小麦、玉米样品中的AF。配对T检验不存在显著差异。,样品编号GB方法本方法差值d1样品编号GB方法本方法差值d1小麦12.12.23-0.13玉米12.83.75-0.95小麦25.15.22-1.12玉米25.75.71-0.01小麦310.212.22-2.02玉米310.611.31-0.71小麦415.314.830.47玉米415.419.2-3.8小麦520.324.63-4.33玉米520.219.850.35小麦625.428.29-2.89玉米625.125.16-0.062.2.2.7方法的验证本方法目前已经北京市农林院，北京市粮油食品检验所，河南口岸食品检测中心，广西粮油食品质量监督检测中心，河南省粮油饲料产品质量监督检验中心等行业内外6家实验室验证。验证样品包括空白玉米样品，空白糙米样品等，其中空白样品用于加标，加标浓度水平为0.5倍限量浓度，限量浓度，2倍限量浓度三个水平。对6个实验室返回的检测结果根据国标GB/