考点加强课7 微生物的筛选、鉴定、分离与计数从近五年全国卷高考看，生物技术实践专题的命题绝大多数立足于微生物培养、应用、分离、计数等。答题过程中须明确所有操作都要围绕着“目的”进行：（1）如果实验目的是分离某种特定的目标微生物；关键点在于如何依据该微生物某方面特点制备特定选择培养基；（2）如果是测定细菌的数量，则必须明确可能会引发数量变化误差的操作（稀释时的倍数、接种过程的无菌操作）备考时务必强化“选择”与“鉴定”的界定及实验方案制定，同时必须熟练把握计数方法及公式套用等。【例证】 （2014全国卷）植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题。（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将分解成。（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（CR）时，CR可与纤维素形成色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的。（3）为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基（成分见下表）：酵母膏无机盐淀粉纤维素粉琼脂CR溶液水培养基甲培养基乙注：“”表示有，“”表示无。据表判断，培养基甲（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是；培养基乙（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_。解析（1）纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，如下图：（2）刚果红可与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过观察是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。（3）分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，且需以纤维素为唯一碳源。答案（1）纤维二糖葡萄糖（2）红透明圈（3）不能液体培养基不能用于分离单菌落不能培养基中没有纤维素，不会形成CR纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌1.分离微生物的原理与措施（1）原理：自然环境中的微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物应首先采用的方法是将单个的细胞与其他细胞分离，再给细胞提供合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。（2）常用措施接种过程中尽量使细胞分散开来，如平板划线法、稀释涂布平板法。运用选择培养基的作用特点，在培养基中添加某种特定的物质，抑制不需要的微生物的生长，促进所需微生物的生长。2.选择培养基四种常见制备方法或实例下面是筛选抗链霉素大肠杆菌的实验步骤及相关图解。实验步骤：把大量对链霉素敏感的大肠杆菌接种在不含链霉素的培养基1的表面，进行培养。待其长出密集的小菌落后，用影印法接种到不含链霉素的培养基2上，随即再影印到含有链霉素的培养基3上，进行培养。在培养基3上出现了个别抗链霉素的菌落，将其挑选出。请回答：（1）配制培养基时除了满足基本的营养条件外，还需满足微生物生长对特殊营养物质、的要求。（2）从功能上看，含有链霉素的培养基属于培养基。若在培养基中加入伊红和美蓝，则培养皿中长出的菌落颜色为。由图可知，1号培养基接种的方法为_。（3）对2和3进行比较，在2上找到与3上相应的菌落，挑取其中一个菌落接种到（填“含链霉素”或“不含链霉素”）的培养基上，如果有较多的菌落出现，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之（填“前”或“后”）。（4）3中的菌落比1、2中的菌落少很多，这说明了基因突变具有的特点。解析（1）配制培养基时在提供几种基本营养条件的基础上，还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。（2）链霉素是抗生素，对大肠杆菌具有选择作用。在伊红和美蓝培养基上.大肠杆菌菌落颜色为黑色。由题图可知，1号培养基接种的方法为稀释涂布平板法。（3）培养基2和培养基3上相同的菌落，是具有相同性状的大肠杆菌形成的，将培养基2中一个相应菌落接种到含链霉素的培养基上，若出现较多的菌落，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之前。（4）抗链霉素性状是大肠杆菌基因突变后获得的性状.3号培养皿中的菌落比1号、2号中的菌落少很多，这说明了基因突变频率很低。答案（1）pH氧气（2）选择黑色稀释涂布平板法（3）含链霉素前（4）频率低/低频性影印法接种的具体过程是：将待测的浓缩菌悬液涂在合适的平板上，等其长好后作为母平板（每个平板上的菌落控制在30300个）；用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，构成印章（即接种工具）；然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下；再把此印章在另一含有选择培养基的平板上轻轻印一下，经培养后，选择培养基平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较影印平板与母平板上菌落生长情况，即可从相应位置的母平板上选出待测的突变型菌落。影印法最初是为证明微生物的抗药性突变是自发的、与相应的环境因素无关而设计的接种方法，目前已广泛应用于营养缺陷型微生物的筛选以及抗药性菌株筛选等研究工作中。【例证】 （2014全国卷，39）为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为。（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_。（3）示意图A和B中，表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。（4）该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高的利用率。解析（1）在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，检测培养基平板灭菌是否合格；每升水样中的活菌数为：（393837）/338，再除以0.1乘以100，得到1毫升中的菌数，再乘以1000就是1升中的菌数，故为3.8107。（2）用平板划线法应先将接种环灼烧灭菌再划线。第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，达到稀释的目的，使得最后能够得到单个菌落。（3）根据图示可知，B为稀释涂布平板法接种后培养得到的菌落。（4）振荡的作用相当于搅拌，可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高了营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。答案（1）检测培养基平板灭菌是否合格3.8107（2）灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落（3）B（4）溶解氧营养物质微生物计数的方法专项归纳1.间接计数法（也叫活菌计数法）常用的是稀释涂布平板法。（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少个活菌。（2）操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布于整个平板表面，放在适宜的温度下培养，计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30300个的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。计算公式：每克样品中的细菌数（C/V）M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。提醒此种方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。2.显微镜直接计数法（1）原理：利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定面积（1 mm2）和高（0.1 mm）的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个（或16个）中格，每个中格进一步划分成16个（或25个）小格，但计数室都是由400个小格组成的。（2）操作：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再将稀释的样品滴在计数板上，稍等片刻，待细菌全部沉降到计数室底部再在显微镜下统计45个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。（3）计算公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010 000稀释倍数。 3.滤膜法以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例，将已知体积的水过滤后，将滤膜放于伊红美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色，可根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。（2017吉林松原模拟）研究人员用有机化合物X、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基成功地从土壤中筛选出能高效降解有机化合物X的细菌（目的菌）。下图是从土壤中筛选出该细菌的过程示意图，下表是分离纯化的结果。请回答下列问题：记录项目：透明圈直径/菌落直径菌落编号12348小时1.62.83.072小时2.21.25.096小时2.31.24.2（1）培养基中的有机化合物X主要为目的菌提供等营养要素。从土壤中富集能有效降解有机化合物X的细菌时，应选用（填“固体”或“液体”）培养基。（2）配制成10倍稀释液时，用无菌移液管从富集液中吸取1 mL，移入盛有mL无菌水的试管中，并依次配制1021010的梯度稀释液。（3）在分离、纯化过程中，图中过程接种的方法分别为、。在倒平板前，应对玻璃器皿和培养基灭菌，灭菌方法是。（4）分析菌种的分离纯化结果，应选择号菌落进行扩大生产，原因是_。解析（1）筛选微生物用选择培养基，培养基中的有机化合物X主要为目的菌提供碳源、氮源等营养要素，不能降解有机化合物X的微生物不能生存。从土壤中富集能有效降解有机化合物X的细菌时，应选用液体培养基，有利于富集培养。（2）配制成10倍稀释液时，用无菌移液管从富集液中吸取1 mL，移入盛有9 mL无菌水的试管中，并依次配制1021