牙髓间充质干细胞生产I 目的：建立牙髓间充质干细胞制品生产规程。II 范围：适用于牙髓间充质干细胞的生产； 适用于技术部和各中心技术组的所有技术人员。III 职责：1. 生产主管负责本制度的执行和监督；2. 技术组的所有技术人员要严格按照本流程的要求进行操作；3. 监督员负责全程监督，并即时按要求填写牙髓间充质干细胞生产记录和生产试剂耗材记录表。附表1 牙髓/骨髓/脂肪/胎盘/脐带间充质干细胞生产记录附表2 生产试剂耗材记录表IV 规程：一、牙髓间充质干细胞原代操作消化法：1.仪器耗材1）10ml移液管2） 培养皿3） 50ml离心管4） 100m筛网5） T75培养瓶6） 15ml离心管2.试剂1）生理盐水2）培养基3）胶原酶3. 酶消化法操作流程3.1 将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写样本取样单，牙齿置于75%酒精中浸泡30min；3.2 取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中；3.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3 ，转移到50ml离心管中，加入生理盐水至30ml,再加入10ml 0.2%胶原酶；3.4 置于37恒温摇床，180rmp消化30min ；3.5 用100m滤网过滤；3.6 1200 rpm离心10min ，吸取洗涤液4ml交给质检，并填写样本取样单；附表3 样本取样单3.7 弃剩余上清，调整细胞浓度为107/ml,置于75cm2培养瓶中,放入37，CO2培养箱中进行培养。4. 组织块法操作流程：4.1 将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写样本取样单，牙齿置于75%酒精中浸泡30min；4.2 取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中；4.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3 ，将组织块均匀铺到T25培养瓶（用适量FBS润湿瓶底）瓶底；4.6 倒置培养瓶，并加入5ml培养基，放入培养箱中培养；4.7 12-24h后，将培养瓶轻轻翻转，将牙髓组织块浸入工作液中。二、牙髓间充质干细胞换液1.耗材1）10ml移液管2）15ml离心管2.试剂培养基3. 操作流程3.1 镜下观察状态细胞；3.2 吸取上清液4ml交给质检，并填写样本取样单；3.3 吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），并补充新的培养基；3.4 观察细胞并将其置于37，5%CO2孵箱中培养。三、牙髓间充质干细胞传代培养1. 耗材1）10ml移液管2）50ml离心管3） 培养瓶4） 15ml离心管2. 试剂1）生理盐水2）胰酶3）血清4）培养基3. 操作流程3.1 显微镜观察，观察培养瓶中的细胞密度到达80%90%，可进行传代培养；3.2 吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），T75培养瓶中加入10ml生理盐水洗涤贴壁细胞； 3.3 吸取洗涤液4ml交给质检，并填写样本取样单；3.4 倒出剩余洗涤液（生理盐水），再加入10ml生理盐水+0.05%胰酶，进行细胞消化，消化的第一瓶镜下观察，细胞收缩即可加入等体积血清终止消化；3.5将细胞收集到50ml离心管中，1200rpm，6min，弃上清，重悬，加入培养基，然后按照1:2或1:3进行传代。四、 牙髓间充质干细胞成品制备1. 耗材1）10ml移液管2）50ml离心管3）15ml离心管4）西林瓶/输血袋2. 试剂1）生理盐水2）胰酶3）血清4）干细胞保存液3. 操作流程3.1 待细胞扩增总数达所需细胞数量后，吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），T75培养瓶中加入10ml生理盐水洗涤一遍；3.2 加入10ml生理盐水+0.05%胰酶，进行细胞消化，消化的第一瓶镜下观察，细胞收缩即可加入等体积血清终止消化；3.3 将细胞收集到50ml离心管中，1200rpm，10min；3.4 弃上清，细胞沉淀用30ml生理盐水洗涤二次，1200rpm，室温离心10min。3.5 取第二次洗涤离心后的上清20ml交给给质检部分，并填写样本取样单；3.6用干细胞保存液/生理盐水重悬细胞，转入专用的无菌西林瓶/生理盐水中，封口，贴标签，放置4保存。3.7 完成初包装后，操作员立即将成品送交包装部门。五、 牙髓间充质干细胞的冻存1. 耗材1）10ml移液管2）50ml离心管3）15ml离心管4）冻存管2. 试剂1）生理盐水2）胰酶3）血清4）冻存液3. 操作流程3.1 将制备好的MSC于1200rpm室温，离心10min。3.2 弃去上清，将细胞悬浮于适量冻存液中，使细胞浓度在107个细胞/毫升，置于低温无菌冻存管中。3.3 将细胞交给库管员经过程控降温后于液氮中冷冻保存，并填写冻存样品交接单。附表4 冻存样品交接单六、 牙髓干细胞的复苏1. 耗材1）10ml移液管2）50ml离心管3）15ml离心管4）培养瓶2. 试剂1）生理盐水2）培养液3. 操作流程3.1 将液氮中的细胞取出于37水浴中迅速融化；3.2 将细胞置于装有1015倍ml生理盐水无菌离心管中，1200rpm离心10min；3.3 弃上清，加入30ml生理盐水洗涤细胞两次；3.4 取第一次洗涤离心后的上清20ml交给给质检部分，并填写样本取样单；3.5 弃上清，重悬细胞，在细胞悬液中加入培养液，吹匀；3.6 将单细胞悬液种植于细胞培养瓶，继续培养。备注：1. 每次进行操作前，需将万级车间和百级实验台照射紫外线30min，风机开启后10-15min后方可进入实验场所进行操作；2. 进入GMP车间后，实验人员先进入物品存放间取已经表面消毒过的垃圾桶、废液缸、实验耗材等进入相应操作间，并从配液间取出相关使用试剂放于实验操作台；3. 细胞的取出与放回：开启培养箱前，需75%擦拭手掌后方可取放细胞；4. 操作细胞过程，手臂尽量在实验台进行操作，不要将手臂反复拿出实验台，如拿出手臂再进入需重新喷洒酒精，方可进入；5. 镜下观察，看是否有杂菌的感染，若有杂菌感染，立即封口后进行清理，不做留用。6. 清场：擦拭操作台，用酒精棉球擦拭每一个有操作接触到过的地方；将废液缸和垃圾桶喷洒75%酒精后放置于污物出口；实验台内未用完的耗材需全部放置于不锈钢推车上，台内不留任何实验耗材；所有试剂归放配液间冰箱。7. 生产各部分均应填写牙髓间充质干细胞生产记录和生产试剂耗材记录表；8. 细胞培养结束以后，监督员需将牙髓间充质干细胞生产记录和生产试剂耗材记录表及时交给总检人员，确认材料齐备无误后，由总检人员负责提档案员整理归档。样本取样单为质检部门内部保管。