项目名称：养殖贝类重要经济性状的分子解析与设计育种基础研究首席科学家：张国范 中国科学院海洋研究所起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：中国科学院 山东省科技厅一、研究内容（一）拟解决的关键科学问题 从基因组学出发，明确贝类基因组结构与特征，阐明重要经济性状的关键基因及其网络调控机制，建立贝类分子设计育种的理论和技术基础，是贝类分子育种领域的关键科学问题，也是实现贝类高效“精确育种”的必要前提。1、贝类基因组结构与特征基因组信息是解析经济性状和实现分子设计育种的基础。通过对牡蛎基因组结构与特征的全面解析，结合其与扇贝、珍珠贝基因组的比较研究，进行贝类全基因组基因功能研究；批量开发基于基因组信息的功能基因和SNP等标记；构建高密度遗传图谱，为贝类生长、发育、抗性、珍珠形成等性状的基因调控网络解析和分子设计育种奠定理论基础。本关键科学问题包含3个重要内涵：基因组结构与功能基因；全基因组SNP和功能基因多态性；基因组序列图谱和高密度遗传图谱。2、重要经济性状的分子解析贝类生长、发育、抗性和珍珠质形成等是贝类重要或特有的经济性状，以功能基因组学为基础，筛选上述性状的关键基因，研究和验证基因的功能和调控机制，阐明基因对性状的决定机制，解析主要性状基因的调控网络，为分子设计育种奠定理论基础。本关键科学问题包含4个重要内涵：目标性状基因/QTL的精细定位；重要经济性状的关键基因及其作用机理；基因表达调控网络；基因型与表型的关联性。3、分子设计育种的技术途径贝类育种的分子设计尚处于起步阶段，亟待开展良种分子设计和预测模型的理论和技术研究，构建模拟育种平台，为分子设计育种提供技术支撑。本关键科学问题包含4个重要内涵：基因、调控网络对环境的反应；育种性状的G-P链接模型和数据库；生长和抗性性状的复合/聚合；模拟育种平台与育种验证。（二）主要研究内容 基于牡蛎全基因组框架图，比较贝类基因组结构，规模开发贝类功能基因和SNP标记；构建全基因组序列精细图谱和高密度遗传图谱。1、贝类比较基因组研究和SNP规模开发在已有的牡蛎框架图基础上，利用物理图谱和BAC文库，构建基因组精细图；完善基因组注释、对基因进行预测和分类，批量开发功能基因；开展牡蛎、扇贝和珍珠贝基因组的比较研究；规模开发贝类SNP标记，建立牡蛎等贝类高密度遗传图谱。2、重要经济性状的分子解析以贝类基因组学研究为基础，发掘贝类生长、发育过程的关键基因，进行功能鉴定并确定其调控途径；开展贝类逆境（温、盐）适应和免疫防御（病毒和弧菌）关键功能基因研究，阐明其作用机制，解析抗性相关过程的调控网络；研究参与珍珠质形成的重要功能基因及其表达调控规律，阐明基质蛋白等在优质珍珠形成中的作用机制；建立基因与性状的关联性。定位目标性状基因/QTL，明确基因型与表型关系。3、分子设计育种的理论和技术基础研究研究变温动物贝类的基因-表型关联体系对环境变动的反应效应，建立基因型和表型性状的G-P模型和相应数据库，开发分子育种计算机模拟技术，开展生长和抗逆性状的复合/聚合育种，建立贝类分子设计育种技术平台，进行模拟育种与实际育种的验证和相互促进。二、预期目标（一）总体目标完成牡蛎基因组的全面解析及其与扇贝和珍珠贝基因组比较研究，明确贝类基因组的结构和特征；批量筛选功能基因和SNP标记，构建高密度遗传图谱；发掘生长、发育、抗性和珍珠质形成等性状相关的关键基因，研究和验证基因的功能和调控机制，揭示性状的基因调控网络；开展分子设计育种技术途径研究，为分子设计育种提供理论基础和技术支持。1、构建牡蛎的基因组精细图谱，比较扇贝、珍珠贝和牡蛎的基因组差异；获得批量牡蛎、扇贝和珍珠贝功能基因和SNP标记；构建高密度遗传图谱。 2、筛选贝类生长、发育、抗性和珍珠质形成等相关的关键基因，阐明其功能和调控机制，解析性状的基因调控网络；阐明基因与性状的关联性。3、构建贝类设计育种技术平台，突破一些设计育种关键技术，为实现设计育种提供可能。4、取得一批国际一流成果，造就一批学科领军人才，凝炼一支具高度创新能力的研究团队。（二）五年预期目标1、基因组的结构特征与SNP规模开发完成牡蛎全基因组序列图谱构建，全基因组覆盖度、基因区覆盖度分别达到95%、98%以上；实现全基因组的基因功能分类；对牡蛎、扇贝和珍珠贝进行全基因组比较，获取三种贝类的典型性状相关功能基因的差异；开发6000个以上贝类SNP等标记，建立贝类高密度遗传图谱，标记间距小于1cM。2、重要经济性状的分子解析及网络调控机理研究定位重要经济性状相关的功能基因/QTL 200-300个，分析QTL的效应；筛选150-200个与重要经济性状紧密相关的功能基因，阐明60-100个重要性状关键基因的功能和调控机制，提出5-10个基因调控模型；筛查10-15个功能SNP多态分子标记，明确其对性状的遗传效应，建立基因型与表型的关系。3、良种分子设计理论和技术基础研究构建2-3个主要育种性状的G-P 模型；实现生长和抗逆性状的复合/聚合育种，研发出计算机模拟育种技术，构建育种模拟技术平台并进行育种验证，辅助应用于新品种的培育。4、培养和建立一支国际一流的创新团队，获得一批具自主知识产权的原创成果造就一批在国内外颇有影响力的中青年学科带头人，打造一支以中青年为主体具高度自主创新能力的团队；培养硕士100名，博士80名、博士后20名以上。发表SCI论文200篇，其中10篇影响因子5.0，顶级刊物研究论文1-2篇，申请国家或国际发明专利40个。三、研究方案（一）学术思路 本项目针对我国海水养殖业良种缺乏，遗传育种基础理论薄弱的现状，凝练出贝类基因组的结构与特征、重要经济性状的分子解析和分子设计育种的技术途径等重大科学问题。选取产业影响大，研究基础好，并已完成全基因组测序的牡蛎作为代表种类，贯穿六个课题所有的研究内容，同时选取与牡蛎近源但主要经济性状有明显差异的扇贝和珍珠贝作为研究对象，聚焦关键科学问题、突出重点，基于组学等前沿生物学技术，深入解析贝类重要经济性状形成的分子基础和调控机制，探究分子设计育种的理论和技术基础。各课题研究内容既各有侧重、又相互关联，形成一个有序衔接和支撑的有机体；既有重大基础理论研究，又有核心技术研发，符合生命科学领域重要基础理论发展和重大关键技术突破相伴产生的规律，易形成重大成果。（二）技术途径本项目将针对海水养殖贝类功能基因、经济性状、分子设计等关键问题，开展海洋贝类重要经济性状的分子解析和分子设计育种的基础理论研究。通过牡蛎全基因组序列及其与扇贝、珍珠贝基因组的比较研究，全面了解贝类基因组结构与特征；在基因组水平大规模开发功能基因和SNP等标记，明确生长、发育、抗性和珍珠质形成等重要经济性状的关键基因、作用机理和途径，为剖析重要性状的分子调控机制和网络奠定基础。通过构建高密度遗传图谱，对QTL进行精细定位，并解析基因-基因、基因-环境相互作用和基因与QTL对性状表现的效应，为分子育种提供理论和技术支持。构建基因型和表型性状关联的G-P模型和相应数据库，为贝类分子设计育种提供关键技术；对贝类从基因到整体不同层次进行设计和操作，进而在计算机平台上对育种程序中的各种因素和重要经济性状进行模拟、筛选和优化，提出分子设计育种的策略和可行性途径。现代科学技术为本项目研究提供了强有力的工具。借助海洋贝类高繁殖力，可构建理想分析群体，以及易于诱导成多倍体等不同类型的遗传材料，在水产学和水生生物学自身学科发展的基础上，充分利用牡蛎等全基因组测序完成这一有利条件，结合生物信息学等学科的先进研究方法和技术，开展多学科交叉研究，发挥后发优势，借鉴现代生物科学的新概念、新观点和新思路以及种植业、畜牧业等所取得的成功经验，创新起步较晚的海水贝类的分子设计育种理论和方法，从而带动和推进水产育种领域基础研究水平提升，实现质的飞跃。上述技术途径如图1所示。主要的技术方法：1、贝类基因组的比较与功能基因批量发掘利用传统Sanger技术和第二代测序技术，并结合物理图谱和BAC文库末端测序，对基因组序列进行组装和拼接，构建牡蛎全基因组精细图谱；结合转录组测序，利用Genscan、GO和KEGG等工具进行基因预测和注释；采用Blast、PAML、KaKs_Calculator等工具，比较牡蛎、扇贝和珍珠贝基因组序列，筛选出重要经济性状相关的批量功能基因。2、贝类SNP规模发掘与高密度遗传图谱构建以SOAP等相关软件来分析确定基因组序列中的SNP等变异，利用Tm-shift、HRM、TaqMan、SNPstream、GoldenGate等分型技术进行验证，获得SNP标记；利用高代参考家系和已获得的标记，进行连锁分析，构建高密度遗传图谱。3、贝类生长和发育的关键基因及其网络调控机制利用比较基因组学和生物信息学方法，基于牡蛎等全基因组序列信息筛查生长发育相关候选基因；应用不同发育阶段基因表达谱、蛋白质组学等筛选鉴定参与调控贝类生长发育的关键功能基因，利用RNA干扰、酵母双杂交等技术查清基因信号通路及其调控网络；应用连锁分析和关联分析，开展生长发育性状相关的QTL定位，应用候选基因法获得生长发育相关基因的功能SNP标记，并确定基因型和表型的关系。4、贝类抗病和抗逆的关键基因及其网络调控机制利用比较基因组学和生物信息学方法，基于牡蛎等全基因组序列信息筛查抗性相关候选基因；利用转录组、蛋白组技术、RNA干扰、DNA重组技术等鉴定主效基因，研究基因功能，建立基因调控网络、调控模型、表达特征和作用机理；应用连锁分析和关联分析，开展抗性相关的QTL定位，确定牡蛎等经济贝类抗性候选功能基因与抗性性状相关关系，并确定基因型和表型的关系。5、贝类珍珠质形成的关键基因及其网络调控机制利用比较基因组学和生物信息学方法，基于牡蛎等全基因组序列信息，筛选珍珠质形成相关的功能基因，采用cDNA微阵列等技术研究功能和表达；利用体外转录因子结合实验（EMS）、免疫共沉淀、RNAi和酵母双杂交等技术研究功能基因的转录调控机理及信号转导通路；利用体外碳酸钙结晶和免疫金标等技术研究基质蛋白对珍珠质形成的调控作用；采用相关/关联分析，开展生长性状相关的QTL定位，鉴定功能性SNP位点，确定单倍型与优质珍珠形成的关系。6、贝类分子设计育种的关键技术研究利用QTL定位、家系分析、遗传环境方差组分分析，研究变温动物类型贝类的基因-表型关联体系对环境变动的反应效应；应用混合线性方程和贝叶斯函数等数量遗传学方法，建立基因型和表型性状关联的G-P模型，开发分子育种计算机模拟技术和相应数据库；构建基于Qu-GENE和Quline系统的贝类育种模拟信息平台，通过模拟、筛选和优化，提出最佳育种策略，开展生长和抗逆性状的复合/聚合育种，建立分子设计育种技术平台。（三）创新点与特色1、对贝类基因组结构与特征得到全新认识率先建立全基因组序列图谱，解析牡蛎等贝类基因组结构与特征，规模发掘功能基因和SNP标记，构建高密度遗传图谱。2、重要经济性状的关键基因作用机理及其调控网络获得深入解析重点抓住生长、发育、抗病、抗逆和珍珠质形成等贝类重要或特有的经济性状，阐明决定性状的关键基因和调控网络；揭示有别于陆生动物的海洋变温动物基因互作、基因-环境互作模式和机理。3、良种分子设计的理论基础和技术取得突破查清基因单倍型与性状的对应关系，构建基因型和表型性状关联的G-P模型和相应数据库，从基因到整体不同层次进行设计和操作，研发贝类模拟育种技术平台。（四）可行性分析1、项目的立项依据充分、技术路线可行本项目所提出的研究方案及技术路线，即基于牡蛎全基因组框架图谱已完成的基础上，通过开展各有关组学研究获得可供育种利用的大量基础