单纯疱疹病毒II型gD模拟抗原表位的筛选及分析 【摘要】目的：用抗HSV2gD单克隆抗体（mAb）从噬菌体随机12肽库中筛选HSV2gD抗原模拟表位序列.方法：利用HSV2gDMcAb淘筛噬菌体随机12肽库，经四轮富集筛选，随机挑取阳性克隆扩增后进行ELISA鉴定，同时提取其基因组DNA进行序列测定，并利用生物信息学软件对包膜糖蛋白（gD）进行B细胞抗原表位分析.结果：经四轮生物淘筛后，特异性噬菌体克隆得到了富集.经过对阳性克隆携带的随机12肽序列进行综合生物信息学分析，得到了PYHH和PPLW两个模拟HSV2gD抗原表位的主要氨基酸基序.结论：用噬菌体随机12肽库成功筛选到了两个模拟HSV2gD抗原表位的主要氨基酸基序，可模拟McAb针对的抗原表位，可能是HSV的替代抗原.该研究方法为研制更有效及更广谱的HSV基因疫苗提供了依据. 【关键词】噬菌体随机肽库单纯疱疹病毒模拟表位 0引言 单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus，HSV)是世界范围内流行的疱疹性疾病的病原体1，现已发现的HSV包膜上的糖蛋白有11种，它们是HSV主要的免疫原，能诱导体液和细胞免疫，产生高滴度中和抗体，激发迟发型超敏反应（delayedtypehypersensitivity，DTH）及T细胞增殖反应，以HSV包膜糖蛋白（glycoproteinD,gD）免疫作用最强2.gD是极为保守的免疫原性蛋白，其在病毒复制和刺激中和抗体的产生中起重要作用，也是宿主细胞免疫和体液免疫反应的主要靶标之一3.噬菌体展示技术（phagedisplay）是近年来发展的一项新的分子生物学技术，是研究抗原抗体相互作用的有力工具，可以从随机肽库中直接筛选能和抗体结合的模拟抗原表位，而这些表位不必预先确定蛋白质的氨基酸残基序列4.本研究利用抗HSV2gD单克隆抗体（mAb）从噬菌体肽库中筛选HSV2gD抗原模拟表位，为进一步研发防治HSV感染的新型疫苗奠定基础. 1材料和方法 1.1材料噬菌体随机12肽库试剂盒，滴度为1.8109pfu/L(美国NEB公司)；特异性抗HSV2gDmAb，属于IgG1，M13DNA抽提试剂盒(北京博菲康生物技术有限公司)；E.coliER2738宿主菌，为F+，四环素抗性转基因组株(北京地坛医院传染病研究所提供)；其余试剂均由北京地坛医院传染病研究所提供. 1.2方法 1.2.1淘筛HSV2gD的模拟抗原表位第一轮淘筛时，取HSV2gDmAb包板，轻摇4过夜，弃去包被液，加满封闭液44h，用洗涤液TBST（50mmol/LTrisHCl,150mmol/LNaCl,1mL/LTween20）快速洗板6次，取原噬菌体肽库2.22L（41010噬菌体）加入100LTBST包被孔中，室温轻缓摇动60min，TBST洗涤去除未结合的噬菌体.用TBST洗涤10次，加入100L非特异洗脱缓冲液（0.2mol/L的甘氨酸盐酸，1g/LBSA，pH2.2）轻摇10min，将洗脱物转入微量离心管中，加入15L1mol/LTrisHCl（pH9.1）中和，取114L洗脱液加入1100稀释的11mL的ER2738培养物中，37振摇4.5h，扩增噬菌体.按相同的方法共进行四轮淘筛，在进行第四轮淘筛时，洗涤时提高吐温20（Tween20）的浓度至3mL/L. 1.2.2阳性克隆鉴定随机挑取第四轮筛选中得到的30个噬菌体克隆做双抗夹心ELISA检测，待检克隆与阴性对照吸光度值之比大于2.1判定为阳性.具体操作步骤严格按照应用噬菌体表面展示肽库快速筛选肽配体使用手册进行. 1.2.3DNA序列测定用M13DNA抽提试剂盒（QIAprepM13Kit）提取噬菌体单链DNA，由北京奥珂测序公司测序.推导相应外源氨基酸序列，并进行同源性比较. 1.2.4生物信息学分析把淘筛所得到的12肽序列融合入M13噬菌体的pIII序列内，处于开放阅读框（ORF）的第19到30个氨基酸位点，应用DNAStarProtean软件提供的模块进行表面可能性、亲水性和抗原指数的分析，以此对两个可能的模拟抗原表位序列进行蛋白二级结构与B细胞抗原识别位点预测. 2结果 2.1肽库筛选共进行了四轮筛选.第一轮筛选投入量为41010pfu(噬斑形成单位)，产出量为2103pfu；第二轮筛选投入量为11011pfu,产出量为2104pfu；第三轮筛选投入量为11011pfu，产出量为5106pfu；第四轮筛选投入量为21011pfu,产出量为2105pfu. 2.2ELISA检测结果通过双抗夹心ELISA法，共有11个克隆与阴性对照吸光度值之比大于2.1，为阳性克隆.阳性克隆率为37%.将此11个阳性克隆命名为P1P11. 2.3序列测定和同源性比较测定11个阳性克隆所携带的外源序列并推导出相应的氨基酸序列.其中7个序列的同源性较高，P6和P7有共同的序列，可见有两个主要氨基酸基序可能为HSV2gD的模拟抗原表位序列即PYHH和PPLW.7个阳性噬菌体克隆的氨基酸序列见表1.表1阳性噬菌体克隆及与HSV2gD氨基酸序列比较P：代表所筛选出来的阳性克隆，为了实验及描述的方便，特按P1到P11命名. 2.4生物信息学分析由表1可见，所筛选的11个阳性克隆有两个模拟抗原表位序列即PPLW和PYHH.P2，P3和P4有共有序列PPLW，经过初步分析P3的氨基酸序列更具有形成HSV2gD模拟抗原表位的可能性.P6，P7和P8有共有序列PYHH，而且P6和P7的序列完全相同，P6和P7的氨基酸序列形成HSV2gD模拟抗原表位的可能性更大.应用DNAStar生物分析软件分析了P3与P6的氨基酸序列. 2.4.1蛋白二级结构PYHH.以P6为代表，GamierRobson法与ChouFasman法预测结果显示P6蛋白无螺旋中心.GamierRobson法预测结果显示P6蛋白有1个折叠区段，2个转角区域，2个无规则卷曲区域.ChouFasman法预测结果显示P6蛋白有3个转角区域.PPLW.以P3为代表，GamierRobson法与ChouFasman法预测结果显示P3蛋白无螺旋中心.GamierRobson法预测结果显示P3蛋白有2个转角区域，2个无规则卷曲区域，2个折叠区段.ChouFasman法预测结果显示P3蛋白有1个转角区域，2个折叠区段. 2.4.2B细胞抗原表位预测结果PYHH.结果表明,所筛选的HSV2gD模拟表位PYHH的位置位于抗原指数、亲水性以及表面可能性强的肽段相对集中区域（第1930个氨基酸位点）（图1）. 3讨论 近年来,利用噬菌体随机肽库技术对模拟抗原表位的研究越来越深入，所谓模拟抗原表位是指噬菌体表达的线型多肽，不仅可以和大分子抗原空间依赖性表位一样引起特异性的强免疫反应，而且可以模拟糖基化表位，可以代替大片段抗原用作疫苗和标准化诊断试剂的研究，因此，确定模拟抗原表位就显得尤其重要.本实验在国内较早筛选出了HSV2gD的模拟抗原表位，并且加以科学的生物信息学分析，为实验结果的准确性提供了有力的理论依据. 转角和无规则卷曲多处于蛋白质的表面，利于与抗体嵌合，成为抗原表位的可能性大5.我们选用DNAStar软件对融合两个模拟抗原表位序列的成熟多肽进行分析，二级结构分析时，可以确定PYHH和PPLW形成抗原表位的可能性都较大.B细胞抗原表位的分析采用3种指标即：PlotKyteDoolittl亲水性，PlotEmini表面可能性，JamesonWolf抗原指数3个参数综合预测.蛋白质亲水性分析结果认为蛋白的亲水部位与蛋白的抗原位点有密切的联系，蛋白质表位常处于表面电荷及极性最大的区域.本研究中所得到的两个抗原模拟表位都具有一定的亲水性，亲水性部位与表位并无很好的一致性，疏水性氨基酸也经常出现在表位中.表面可能性方案也是一种亲水性分析，指蛋白抗原中氨基酸残基与溶剂分子接触的可能性,它反映了蛋白抗原内外各层各残基的分布组成.现代免疫学理论认为，1个表位中起关键作用的氨基酸可能只有23个，其余的则起辅助作用6.综合以上分析结果，可以确定PYHH和PPLW都可能是HSV2gD的抗原模拟表位基序，但是否能作为糖蛋白的替代抗原尚需对其免疫原性进一步做动物实验加以验证.筛选结果中有4个克隆同源性不高或游离于基序之外，可能是弱结合能力的克隆，也可能是操作过程中造成的非特异性结合.由于gD糖蛋白较大，很难将67种糖蛋白序列均导入一个基因工程载体中.本研究筛选到的序列通过深入研究其抗原性，可以作为HSV包膜糖蛋白替代抗原，则有可能将多个抗原基因导入同一基因工程载体中，可为HSV基因工程疫苗特别是核酸重组疫苗的研究提供依据. 【参考文献】 1AurelianL.HerpessimplexvirusType2vaccines:NewgroundforoptimismJ?ClinDiagnLabImmunol,2004,11：437-445. 2陈爱荣.单纯疱疹病毒的研究现状与展望J.微生物学免疫学进展,2003，31(2):62-63. 3孟祥俊.单纯疱疹病毒糖蛋白的特性及其临床意义J.国外医学:病毒学分册,2002,9(6):184-185. 4WangLF,YuM.Epitopeidentificationanddiscoveryusingphagedisplaylibraries:ApplicationinvaccinedevelopmentanddiagnosticsJ.CurrDrugTargets,2004,5(1):1215-1219. 5ApostolopoulosV,YuM,CorperAL,etal.CrystalstructureofanoncanonicallowaffinitypeptidecomplexedwithMHCclassI:AnewapproachforvaccinedesignJ.JMolBiol,2002,318(5):1293-1305. 6杨乔欣，马文煜，余颖.单纯疱疹病毒糖蛋白模拟位的研究J.免疫学杂志，2002，18（2）：146-148.