免疫组化结果分析篇1：免疫组化（IHC）经验超全总结做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时 间去积累和摸索经验。我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理 相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想, 最终结果未能达到预期的效果。经过一段时间的浏览和学习，在论坛内学习、请教，并结合 实践操作，我经历了初级一一查找资料和摸索方法；中级一一问题求助和不断总结：髙级一 难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起 分享。一、石蜡切片和冰冻切片的比较？要求做冰冻切片的不一泄能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡 切片时要髙温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳左，则可作石蜡切片： 但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这 一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散：切片厚度较石蜡的厚, 做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做 冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较 麻烦，一立要存在-80oC的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解, 保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到左右,所以原位杂交探针容易渗透到组织中去, 容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。二、一抗的选择要点和技巧是什么？单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗 体能目标明确地与单一的特异抗原决左簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。列一方而， 即使是同一个抗原决左簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗 体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对 小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度髙， 但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。应用范围的选择。有的一抗只能用于WB （Westernblotting）或免疫组化、免疫荧光、 免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。种属反应性的选择。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合 检测哪种种属动物体内的抗原。种属来源，一般兔来源的多是多克隆：而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。生产厂家的选择。不同厂家的同一种抗体，它的实际效价稳泄是不同的，有的做免疫组 化效果较好，有的WB效果却更好一些。三、在什么情况下使用Triton-XlOO?TritonX-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基联，是一种去污剂。在免疫组织化学（10 um 以上厚切片）和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。其作用原理TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大 分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利 进入胞内与相应抗原结合。TritonX-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。四、封闭血淸的选择原则是什么？膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性。封闭血淸一般是和二抗同一来源的，血淸中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反 应的位点发生结合，否则在后而的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。也可以用小牛血淸、BSA、羊血淸等，但不能与一抗来源一致。五、抗体孵育条件的比较？一抗孵冇温度有几种4oC、室温、37oC,其中4oC效果最佳：孵冇时间这与温度、抗体 浓度有关，一般37oC, l-2h,而4oC过夜和从冰箱拿出后37oC复温45min。二抗一般室温或37oC, 30min-lh,具体时间需要摸索。六、一抗4C孵育后为什么要进行37C复温？一方面，防止切片从4oC直接放入PBS易脱片。另一方而，使抗原抗体结合更稳左。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4oC 和37oC时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏 感性也提高了井易造成非特异染色。其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4C过夜拿出后，直接用 PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩。七、DAB显色时间如何把握?DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗。DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓 度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短抗体孵冇时间。若很短时间就出现背景很深，还有可能是你前而的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封 闭时间。DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才岀现阳性染色，一方而可能说明你的抗体浓度 过低或孵疗时间过短（最好一抗4oC过夜）；另一方面就是封闭时间过长。八、免疫组化结果如何分析？阳性着色细胞讣数法。在40倍光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数 阳性着色细胞，每组3-6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。灰密度分析法。通过在不同组別和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用 imagej进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0-3分为阴性着色、淡黄色、 浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1 -4分为0-25%. 26-50%、51-75%、76-100%）,最终 可以分数相加，再进行比较。对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着 色均匀、背景很注的高质量切片。九、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固左过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭 作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决左族重新疑露，提高抗原检测率。修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干 种（具体的可以査阅相关资料，大量的中性的、髙pH的等）。微波修复，我们一般用6min*4次，效果不错。十、内源性过氧化物酶的火活时间和浓度是什么？一般3$过氧化氢灭活时间短点，可以lOmin左右：而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭 时间，一般 10-30min。用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS好在保护抗原和固左组织作用，过氧化氢孵冇时间过长易引起脱片。现用现配，配好后4oC避光保存。十一、如何才能充分脱蜡？蜡不溶于水，如果脫蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、阳性物时 隐时现、真假难辨、背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡， 目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短：脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜程度决泄。如果在夏天，室温较髙，脱蜡试 剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5min就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较 陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20min或更长。当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度时进行脱蜡可加速脱蜡的过程， 如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20min,然后再行脱蜡，这 样脱蜡速度加快，效果会更好。总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决泄，脱蜡的时间，原则 上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。十二、如何最大限度地降低组织非特异性染色？缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条；一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议用单克隆抗体看看；内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通 过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色：非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血淸封闭时间和适当增 加浓度来加强封闭效果；缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等：适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。十三、苏木素复染时间的把握？苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的左位等情况，一般数秒-数分 钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即染色深则分化时间稍长些即可：染色浅则再置 于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸洒精 中数秒（动作一泄要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。十四、PBS的淸洗方式选择、次数和时间的选择？单独冲洗，防止交叉反应造成污染。临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后， 将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行 冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。温柔冲洗，防止切片的脱落。冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片 将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一泄的冲击力，很容易使切片周边引起松动， 导致切片的脱落。冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法 一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于 切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS, 持续2min左右就完全足够了。PBS的pH和码子强度的使用和要求。刘彦仿指岀中性及弱磴性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于 分解：低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。我们目前常用的 PBS的pH在4-6,浓度是0. 01M,根据本室十几年来的使用情况，认为该溶液价格便宜配制 方而，使用效果好。常用试剂的配制和使用。在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中， 抗体的加、换、切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至 关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。十五、脱片产生的原因和如何防止脱片？多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，后而补做第二批时用的病理科老师自己做 的片子，要好一点。组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切得厚或者不均匀，或者切片者手 法不好等。组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。没烤好，时间短温度不够之类。操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢 吸水。修复的问题抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进lOOoC的修复液时手法不好，咚 的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠掾酸容易脱片，但是你要用到 EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。 基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。十六、背景染色较深的原因有哪些？抗体浓度过髙一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对 苴工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即 用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染