复旦大学附属中山医院医院感染管理科文件名称：微生物实验室生物安全管理SOP文件编号：ZS-IC-SOP-swaq持有部门：临床微生物实验室，医院感染管理科制订者：周昭彦审核者：胡必杰核准者：胡必杰制订日期：2007年5月28日审核日期：2007年5月29日核准日期：2007年5月29日执行日期：2007年6月 1日版次：Ver 01文件页数：共7页文件性质： 普通 限制（仅限本院范围，未经授权，不得复制）目录1.前言2.实验室生物安全规程 2.1.进入规定2.2.个人防护2.3.实验室工作区3.实验室安全操作3.1.标本的安全操作3.2.实验室的基本安全操作3.3.实验室的其他安全操作4.实验室设备和仪器4.1.生物安全柜4.2.离心机4.3.组织研磨器4.4.冰箱与冰柜的维护和使用5.实验室意外事件或事故处理5.1.生物危害物溢出的处理5.2.刺伤、切割伤或擦伤5.3.经胃肠道摄入潜在感染性物质6.实验室废弃物处理6.1.培养基、组织、体液等废弃物处理6.2.锐器盒处理7.参考文献8.负责人及联系电话1.前言由于新的感染性病原体的不断涌现，抗生素的耐药性问题日益严重，新的诊断和治疗技术的应用，以及生物恐怖的潜在危险，提高实验室的生物安全再一次成为人们的关注点。临床微生物实验室工作人员面临着职业暴露于感染性病原体的危险。其中，最危险的操作是标本的处理和接种。由于人员感染后处于亚临床表现或实验室管理层没有上报，实验室获得性感染的实际发生率可能比已知的多得多。采用适当的生物安全防护可以将感染的危险性降至最低。生物安全防护包括安全设备、个体防护装置和措施，实验室的特殊设计和建筑要求，严格的管理制度和标准化的操作程序及规程。其中，规范的微生物学操作技术是实验室生物安全的基础，专门的实验设备仅仅是一种补充，绝不能替代正确的操作规范。根据有关规定，中山医院临床微生物实验室属于二级生物安全水平实验室。2.实验室生物安全规程2.1.进入规定2.1.1.在实验室入口处贴生物危害警告标志，见上图。注明临床微生物、级生物安全水平、负责人高晓东，电话；2.1.2.未经许可，非工作人员不得进入实验室。外来合作者、进修和学习人员在进入实验室之前必须经过部门负责人（胡必杰）的批准；2.1.3.实验室总门应保持关闭状态；2.1.4.与实验室工作无关的动物不得带入实验室。2.2.个人防护2.2.1.工作服：在实验室工作时，必须穿着工作服；2.2.2.手套：在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料的操作时，应戴上合适的手套。脱手套后必须洗手。用过的一次性手套应丢入感染性废物袋内（贴有生物危险级标志的黄色垃圾袋）；2.2.3.洗手：在处理完感染性材料后，以及在离开实验室前，都必须洗手。手要完全抹上皂液，搓洗至少10 秒钟，纸巾擦干；2.2.4.其他防护：当有可能受到喷溅物污染、碰撞或人工紫外线辐射的伤害时，必须戴合适的安全眼镜；2.2.5.不得穿着实验室工作服离开实验室；2.2.6.不得在实验室内穿露脚趾的鞋子；2.2.7.禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜；2.2.8.禁止在实验室工作区域内储存食品和饮料；2.2.9.在实验室内用过的工作服不得和日常服装放在同一柜子内。2.3.实验室工作区2.3.1.实验室应保持清洁整齐，严禁摆放和实验无关的物品；2.3.2.每天工作结束之后，必须用爱尔施牌消毒片(成分：三氯异氰尿酸，每片含有效氯500mg，按每片 1000ml水比例进行溶解)消毒工作台面。用75%酒精消毒生物安全柜台面。活性物质溅出后要随时消毒，消毒剂为爱尔施（1片/1000ml），严重污染时(血液等标本的污染)，将6片爱尔施溶于1000ml水（3000ppm）用以消毒；2.3.3.所有受到污染的材料、标本和培养物应废弃于感染性废物袋内，而生活垃圾应弃于黑色垃圾袋，不能混淆。需要清洁再利用的材料，必须先经高压灭菌处理；2.3.4.需要带出实验室的手写文件必须保证在实验室内没有受到污染。3.实验室操作技术3.1.标本的安全操作3.1.1.标本容器：标本用防漏的有盖的塑料容器盛装，容器上贴标签。化验单不能卷在容器外面，而是要分开放置；3.1.2.标本接收：在实验室专门的接收窗口接收标本；3.1.3.打开包装：容器要在生物安全柜内打开，并准备好爱尔施消毒剂。容器有破碎或标本泄漏时，根据标本拒收SOP予以拒收，并填写拒收单。3.2.实验室的基本安全操作所有标本在生物安全柜内操作，要尽量减少气溶胶和微小液滴形成。在工作台面放置一块浸有爱尔施消毒液的纱布，使用后按感染性废弃物处理。表1.实验室的基本安全操作感染性物质传播途径材料和操作目标正确的操作经呼吸道吸入接种针和环避免被接种物洒落微生物接种环的直径为23mm完全封闭，长度小于6cm 以减小抖动接种标本避免产生气溶胶电子加热器消毒接种环不在培养基上冷却接种环在培养基上划线避免病原体溅起轻轻划线标本涂片避免产生气溶胶不直接倒在玻片上痰液涂片干燥避免产生气溶胶不用明火烧移液管避免产生气溶胶不能反复吹吸混合含有感染性物质的溶液不需要排出最后一滴液体经消化道摄入移液管避免经口摄入严禁用口吸移液管实验材料避免经口摄入严禁将实验材料置于口内严禁舔标签不能在实验室内饮食和储存食品，嘴里不应有笔或口香糖等物品皮肤和眼睛接触戴手套避免接触感染性物质操作时应戴一次性手套，避免触摸口、眼及面部锐器损伤皮下注射针头避免意外注入感染性物质减少使用注射器和针头用过的针头禁止折弯、剪断、折断、重新盖帽、从注射器取下，禁止用手直接操作注射器不能用于移液针头、玻片以及破碎的玻璃避免意外受伤丢弃在锐器盒中血培养瓶避免锐器损伤针刺入瓶时注意安全3.3.实验室的其他安全操作3.3.1.血清分离 操作时应戴手套及防护眼镜； 血液和血清应当小心吸取，而不能倾倒。严禁用口吸移液管； 移液管使用后应完全浸入爱尔施中浸泡30min。然后高压灭菌（121 1-1.5bar 20min）,清洗消毒后备用； 带有血凝块等的废弃标本管，在加盖后放入感染性废物袋在内高压灭菌； 备爱尔施消毒剂清除喷溅和溢出标本。3.3.2.装有冻干感染性物质安瓿的开启 在生物安全柜内操作； 首先用75酒精清洁安瓿外表面； 如果管内有棉花或纤维塞，可以在管上靠近棉花或纤维塞的中部锉一痕迹； 用75酒精浸泡的纱布将安瓿包起来以保护双手，然后手持安瓿从标记的锉痕处打开； 将顶部小心移去，放入锐器盒内； 如果塞子仍然在安瓿上，用消毒镊子除去，弃于感染性废物袋内； 缓慢向安瓿中加入营养肉汤以重悬冻干物，避免出现泡沫。4.实验室设备和仪器4.1.生物安全柜（Class，ESCO）4.1.1.操作步骤 开启电源和内外风扇； 在机器预热时将所有必需的物品置于安全柜内； 准备一块浸有75%酒精的沙布； 开始工作前及完成工作后，让安全柜工作5min 来完成“净化”过程； 手和双臂伸入到生物安全柜中等待大约一分钟，以使安全柜调整完毕才开始对物品进行处理； 接种环灭菌时，用电子加热器，而不应使用明火； 在实验结束时，生物安全柜里的所有物品都应清除表面污染，标本和培养基移出安全柜； 每天实验结束时，用75%酒精擦拭工作台面、四壁及玻璃的内外侧等部位来清除污染； 有标本溢出等污染时，用爱尔施消毒，然后用水再次进行擦拭。4.1.2.注意事项 每次开始实验之前将所需物品置于安全柜内，以尽可能减少双臂进出次数； 双臂应该垂直地缓慢进出前面的开口； 尽量减少操作者身后的人员活动； 生物安全柜在使用中不能打开玻璃观察挡板； 在生物安全柜内操作时，不能进行文字工作； 级生物安全柜前面的进气格栅不能被纸、仪器设备或其他物品阻挡； 所有物品应尽可能地放在靠近工作台后缘的位置，但不阻挡后部格栅； 可产生气溶胶的设备（如混匀器、离心机等）应靠近安全柜的后部放置； 生物危害性废弃物袋放在安全柜内右侧，袋中放入爱尔施消毒剂； 房间中有人时要关闭紫外灯，以保护眼睛和皮肤，避免因不慎暴露而造成伤害； 安全柜一直维持运行状态（8小时工作期间），不能反复开关； 当气流警报响起时，立刻停止工作，并报告生物安全负责人（高晓东）。4.2.低温超速离心机（AllegraTMX-12R，BECKMAN COULTER）4.2.1.按照操作手册操作离心机；4.2.2.正确放置十字轴和离心桶；4.2.3.在使用前检查离心管和盛放离心标本的容器是否破损；4.2.4.用于离心的试管和标本容器应当牢固盖紧；4.2.5.离心桶的装载、平衡必须在生物安全柜内进行；4.2.6.离心桶和十字轴按重量配对，并在装载离心管后正确平衡；4.2.7.离心管不能装得过满，液面距离心管口留出一定空间，否则会导致漏液；4.2.8.空离心管用蒸馏水来平衡；4.2.9.每次使用后，要用75酒精清除离心桶、转子和离心机腔的污染；4.2.10.每天检查离心机转子部位的腔壁是否被污染或弄脏，离心转子和离心桶是否有腐蚀或细微裂痕。4.3.组织研磨器4.3.1.戴上手套并用含75酒精的纱布包住玻璃研磨器；4.3.2.在生物安全柜内进行组织研磨器的打开和操作。4.4.冰箱与冰柜的维护和使用4.4.1.冰箱和低温冰箱通常每半年除霜和清洁，如有特殊情况应立即除霜和清理，清理出在储存过程中破碎的安瓿和试管等物品。清理时应戴厚橡胶手套并进行面部防护；4.4.2.储存在冰箱内的所有容器清楚地标明内装物品的名称、储存日期和储存者的姓名。未标明的或废旧物品应高压灭菌后丢弃；4.4.3.由微生物室组长（周春妹）保存一份冻存物品的清单；4.4.4.冰箱内不能放置易燃溶液。5.实验室意外事件或事故处理工作人员在操作过程中发生意外，如针刺和切伤、皮肤污染、感染性标本溅及体表和口鼻眼内等视为安全事故。出现生物危害物的溢出、事故以及明显或可能暴露于高传染性物质时，必须向部门负责人主任（胡必杰）报告。实验室保存这些事件或事故的书面报告。生物危害物的溢出是指具有高度传染性或危害性的感染性物质（如结核分枝杆菌）的明显溢出（如标本打翻或离心管破裂）。5.1. 生物危害物的溢出处理5.1.1.潜在危害性气溶胶的释放（在生物安全柜以外） 所有人员必须立即撤离相关区域； 立即报告部门负责人； 为了使气溶胶排出和使较大的粒子沉降，在1 h 内严禁人员入内； 门口张贴“禁止进入”的标志，过了相应时间后，在生物安全负责人（高晓东）的指导下来清除污染；生物危害物溢出清除程序：1) 戴手套、口罩，穿防护服，必要时进行脸和眼睛防护；2) 用布覆盖并吸收溢出物；3) 向布上倾倒爱尔施消毒剂（6片溶于1000ml水），并覆盖周围区域；4) 使用消毒剂时，从溢出区域的外围开始，朝向中心进行处理；5) 作用60min后，将布以及污染材料清理掉。如果含有碎玻璃或其他锐器，