药物性耳聋线粒体12S rRNA基因1555G点突变基因检测的实验室技术体系人头发毛囊组织DNA提取方法的研究技术保障与研发部 魏宏泉摘要 本研究以人头发的毛囊组织为材料，在动物组织总DNA提取的经典技术方案基础上，兼顾效率、成本和产率等三方面因素，对毛囊组织DNA提取方法进行了优化，并设计了实用有效的取样方法。研究结果显示，可以以少至一根带毛囊的头发为材料，在40分钟时间内获得约0.5mg组织DNA，其产量和质量可以满足基因检测工作后续流程的需要。同时，一次提取过程所耗药品试剂的成本约为0.3元，大大低于以微量血为材料的试剂盒提取法的成本。在以RFLP法对线粒体12s rRNA基因1555位点进行基因检测的技术体系中，组织DNA提取是实验室工作的第一步，该工作的效率、质量、成本等因素对整体检测流程具有至关重要的影响。在此之前的研究工作中，我们确定了以微量血为材料提取组织DNA的技术方法，但为了使基因检测项目的实施具有更强的可操作性，设计多样化的组织样本采集形式则是必需的。为此，本研究以人头发毛囊组织为材料，旨在建立适用的取样方法和DNA提取方法的技术体系。1. 材料与方法人头发毛囊组织取自健康成年人。取样方法：用镊子夹住头发根部的部位，顺着毛发生长方向用力一拔即可，此时在毛发根部应明显可见白色或半透明的毛囊组织。然后用剪刀剪去大部分的毛干部分，将毛根带有毛囊组织的部分置于1.5ml Eppendorf管内。试剂配制（1） Proteinase K Proteinase K用去离子水溶解，浓度20mg/ml。（2） 组织消化液 10mM Tris-HCl，pH7.5 10mM EDTA 10mM NaCl 0.5 SDS（3） LiCl溶液 无水LiCl用去离子水溶解，浓度为7.5M。（4） TE溶液 10mM Tris-HCl，pH7.5 0.1mM EDTA，pH8.0参考操作程序（1） 加入60ml消化液，再加入1ml蛋白酶K溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟。（2） 于55水浴2小时。（3） 加入60ml LiCl溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟，冰浴10分钟。（4） 13 000rpm离心15分钟，将上清移入一个新的离心管中。（5） 加入240ml无水乙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟。（6） 13 000rpm离心10分钟，弃上清，用70乙醇将沉淀洗一次。（7） 13 000rpm离心5分钟，弃上清，并将残留乙醇吸干净，室温干燥20分钟。（8） 加入20ml TE缓冲液溶解DNA。（9） 用1琼脂糖凝胶电泳进行检测。头发数量对DNA提取结果的影响将拔取的头发分为6组，分别为1、2、3、4、5、6根头发，按1.3中的参考操作程序进行操作，提取DNA并用电泳检测结果。蛋白酶K消化对DNA提取结果的影响（1） 将拔取的头发分为4组，每组1根，在操作程序中加入蛋白酶K后，55水浴时间分别为15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，其余步骤按参考操作程序进行。（2） 将拔取的头发分为6组，每组2根，在操作程序中加入蛋白酶K后，55水浴时间分别为0分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟，其余步骤按参考操作程序进行。（3） 将拔取的头发分为6组，每组2根，其中5组在操作程序中加入的蛋白酶K浓度分别为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml，最后一组不加蛋白酶K，其余步骤按参考操作程序进行。（4） 将拔取的头发分为5组，每组1根，在操作程序中不进行加入蛋白酶K及水浴步骤，其余步骤按参考操作程序进行。优化操作程序的多样本比较实验以五个人为对象，各拔取两根头发作为样本分为两组，每组一根头发，共计10组，以下列操作程序提取DNA：（1） 加入60ml消化液，再加入1ml蛋白酶K溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟。（2） 于55水浴10分钟。（3） 加入60ml LiCl溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟，冰浴10分钟。（4） 13 000rpm离心10分钟，将上清移入一个新的离心管中。（5） 加入240ml无水乙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟。（6） 13 000rpm离心10分钟，弃上清，用70乙醇将沉淀洗一次。（7） 13 000rpm离心5分钟，弃上清，并将残留乙醇吸干净，室温干燥20分钟。（8） 加入20ml TE缓冲液溶解DNA。（9） 用1琼脂糖凝胶电泳进行检测。（10） 各取2ml DNA溶液作为模板进行PCR，PCR反应体系及程序设置按照“药物性耳聋易感基因检测的RFLP标准操作程序”进行。2. 结果与分析2.1 头发数量对DNA提取结果的影响 以1-6根头发为材料，每组都可以有效提取出基因组DNA，1-3根头发组的DNA产量有较为明显的随头发数增多而产量也增多的变化，3-6根头发组的DNA产量则没有明显差别。如图1所示。Lane1：一根头发提取DNA的结果Lane 2：二根头发提取DNA的结果Lane3：三根头发提取DNA的结果Lane 4：四根头发提取DNA的结果Lane5：五根头发提取DNA的结果Lane 6：六根头发提取DNA的结果Lane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band )1 2 3 4 5 6 M 2000bp图1 头发数量对DNA提取结果的影响在图1显示的电泳结果中，第1、2、3条带的亮度逐渐增加，说明随着头发数的增加其相应的DNA产量也随之增加，而第3、4、5、6条带的亮度差异不明显，说明所获得的DNA产量基本相同注注1：DNA条带的亮度差异包含因不同样本的毛囊大小不同而导致的DNA产量差异这一因素，本研究中对此差异忽略不计。本研究中各实验都存在此现象，在此一并说明，后文不再一一注解。而事实上1-6根头发中所含DNA的量应该是随头发数量增加而递增的，出现这种矛盾现象的可能原因是：相同的消化液和蛋白酶K使用量并不适用于处理不同数量头发。在本实验中，所使用的60ml消化液和1ml蛋白酶K可能是对应于1-3根头发的合适用量，可以达到完全裂解细胞膜和细胞核并释放DNA的效果，而4-6根头发可能造成了蛋白酶反应底物的过量，这些过量的组织细胞并没有被裂解，因此所释放出的总DNA量仍与1-3根头发释放的DNA量相当。从电泳结果显示的条带亮度来看，由于所使用的DNA分子量标准每条带的亮度约为20ng，因此可以估测认为，本实验从一根头发中提取出的基因组DNA约为400-600ng，该产量对于基因检测的技术实施来说已经足够，完全可以满足后续工作的需要。2.2 蛋白酶K消化对DNA提取结果的影响在蛋白酶K反应体系中，组织样本中细胞的裂解率是受酶促反应时间和酶与底物比例影响的。本实验中各组均以一根头发为材料提取DNA，同时所使用的蛋白酶K适度过量，结果DNA产量出现了随时间而变化的梯度上升。（1）蛋白酶K消化时间对DNA提取结果的影响。1 2 3 4 M Lane1：水浴15分钟所提取的DNALane 2：水浴30分钟所提取的DNALane3：水浴45分钟所提取的DNALane 4：水浴60分钟所提取的DNALane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band )2000bp图2 蛋白酶K消化时间对DNA提取结果的影响（1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 2000bpLane1-2： 未进行水浴所提取的DNALane 3-4：水浴10分钟所提取的DNALane5-6：水浴20分钟提取的DNALane 7-8：水浴30分钟提取的DNALane 9-10：水浴60分钟提取的DNALane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band )图3 蛋白酶K消化时间对DNA提取结果的影响（2）从图2可以看出，蛋白酶K消化时间与DNA产量之间的对应关系是：在30分钟之内，细胞裂解率与消化时间成正比，而超过30分钟之后，DNA产量不再增加。产生这一现象的原因可能是：在60ml消化反应体系中加入1ml蛋白酶K已经达到过量的水平，虽然参考程序中建议消化2小时，但本反应体系在反应进行到30分钟时已经将组织细胞全部裂解。进一步的计算结果表明，该反应体系中蛋白酶K的实际工作浓度为333ng/ml，而哺乳动物组织DNA提取的经典技术方案中推荐的蛋白酶K工作浓度一般是100ng/ml，本实验中蛋白酶K过量2.3倍，因此，原本应该会产生的随消化时间（30-60分钟时间段）而变化的DNA释放效率因酶的过量而被弥补了。在图3中可以看出，在进一步的实验结果中也显示了同样的现象：即10-30分钟时，细胞裂解率与消化时间成正比，而超过30分钟之后，DNA产量不再增加。同时我们也可以看到，不进行水浴是无法得到DNA产物的，这也进一步说明了蛋白酶K在消化液成分中的重要性，以及适宜温度对酶促反应的重要性。（2）蛋白酶K用量对DNA提取结果的影响1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M Lane1-2： 20mg/ml蛋白酶K组Lane 3-4：10mg/ml蛋白酶K组Lane5-6： 5mg/ml蛋白酶K组Lane 7-8： 2.5mg/ml蛋白酶K组Lane 9-10：1.25mg/ml蛋白酶K组Lane 11-12：无蛋白酶K组Lane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band )2000bp图4 蛋白酶K用量对DNA提取结果的影响（1）1 2 3 4 5 M Lane1-5：无蛋白酶K的平行实验组 Lane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band )2000bp图5 蛋白酶K用量对DNA提取结果的影响（2） 如图4所示，当使用的蛋白酶K的浓度为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml时，DNA产量大致相当，其中5mg/ml组较其它两组为少。当使用的蛋白酶K的浓度为2.5mg/ml、1.25mg/ml时，DNA产量较前三组明显减少。无蛋白酶组中只有一个样本有少量DNA产物。将使用的蛋白酶K用量换算成终浓度，则各组中蛋白酶K的工作浓度分别为333.3ng/ml、166.7ng/ml、83.3ng/ml、41.6ng/ml、20.8ng/ml，如果以100ng/ml做为反应体系中蛋白酶K的标准工作浓度，可以在发现2.5mg/ml组和1.25mg/ml组中，蛋白酶K用量显然不足，因此DNA产量较前三组明显减少。图5显示的是无蛋白酶K及其55水浴步骤时DNA提取的结果。将这一结果和图4显示的结果相比较，我们可以发现消化液与蛋白酶K在释放DNA过程中有效反应条件的差异：当无蛋白酶K参与反应时，55水浴处理可以增强消化液的作用效果，其结果是也可以释放部分DNA，但如果减去了水浴处理步骤，在室温条件下，消化液则不能起到有效释放DNA的作用。参照图3显示的酶促反应条件结果，即便消化液与蛋白酶K同时存在，如果不进行55水浴处理仍然不能起到应