生物化学与分子生物学进展（基础）概论、目的基因分子克隆的载体核酸序列分析聚合酶链反应（自学）分子克隆技术常用的工具酶（自学）肿瘤转移的分子机制新生血管研究与转化医学细胞周期与细胞增殖基因打靶的设计与实现细胞分化的分子机制医学系统生物学和蛋白质组学细胞信号转导一、1.操纵子那张图以乳糖操纵子为例，其组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I存在诱导物（乳糖）时，mRNA得到转录；不存在诱导物时，mRNA无法转录。（1）阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。（2）CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。2.概念（1）基因诊断：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽。（2）基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。包括直接导入外源正常基因、采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因、将特定的基因导入非病变细胞等。（3）pBR322：大小为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚，是最早应用于基因工程的大肠杆菌质粒载体之一，有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个。（4）pUC质粒系列：是在pBR322基础上改建成的。大小约2.69kb，去除了pBR322的抗四环素区段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker。含有易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ，可利用互补原理进行蓝白筛选。3.分子医学的主要研究内容分子医学是指从基因的角度重新认识疾病，运用基因技术预防、诊断和治疗疾病。研究内容主要包括疾病的分子机理、基因诊断、基因治疗和基因预防这四个方面。（1）疾病的分子机理：探索疾病的原因，是有效治疗疾病的前提。基因科学的发展，为人类从细胞内部的微观生理学和分子生物学水平上寻找病因提供了新的思路。以尿黑酸症为例，一种常染色体隐性遗传病，病因为先天性缺乏尿黑酸氧化酶基因表达。（2）疾病的基因诊断：从广义上讲，大多数疾病都可以从遗传物质的变化中寻找出原因。而从技术上看，只要找到了与疾病相关的基因，基因诊断便立即可以实现。以P53抑癌基因为例，典型症状出现之前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表达出来了。（3）疾病的基因治疗：即是通过基因水平的操作来治疗疾病的方法。包括体细胞治疗和生殖细胞治疗两种，后者所产生的性状可代代相传。（4）疾病的基因预防：研制基因疫苗，即能编码某种特异性抗原并在人体或动物体细胞内表达这种抗原的DNA或RNA等。4.基因载体在基因工程中的作用基因载体的功能包括运送外源基因高校转入受体细胞、为外源基因提供复制或整合能力以及为外源基因的扩增或表达提供必要的条件，分为质粒、噬菌体、腺病毒载体、逆转录病毒载体等。质粒载体的主要用途有：（1）保存和克隆小于2kb的目的基因，（2）构建基因组文库和cDNA文库，（3）用于目的基因的测序，（4）作为核酸杂交时探针的来源。噬菌体可以容纳较大的目的基因，基因文库构建常使用载体。二、1. 掌握PCR技术的原理及基本步骤 PCR技术的原理：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。基本步骤：包括变性-退火-延伸三个基本反应步骤。（1）DNA变性(90-96)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。（2）退火(复性)(40-65)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。（3）延伸(68-75)：在Taq酶(在72左右最佳的活性)的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链2. 熟悉PCR技术的广泛应用（1）生物学基础研究 目的基因扩增和鉴定；DNA序列测定；定点突变；基因表达分析（2）医学临床应用遗传疾病基因诊断；致病病原体检测；癌基因检测；器官移植组织配型（3）法医学物证鉴定个体识别；亲子鉴定（4）其他 动、植物检疫（转基因动植物检测）；生物物种鉴定，系统进化研究；分子考古学（恐龙DNA分析）等三、1. 试从PCR的原理和应用角度，谈谈其有何实用价值2.为了不同的实验需要，产生了不同种类的PCR，其各自的作用是什么？1）不对称PCR：扩增产生特异长度的单链DNA，采用两种不同浓度的引物，可用于制备核酸序列测定的模板、制备杂交探针和基因组DNA结构功能的研究2）反向PCR：可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。3）多重PCR：在同一PCR反应体系中，设计多对引物，同时扩增一份DNA样品中几个不同靶区域的DNA片段，这一过程称为多重PCR。可用于检测特定基因序列的大小、缺失、突变是否存在。4）LP-PCR：利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记，用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分。5）锚定PCR：首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增。PCR的局限-需了解靶基因片段两侧的序列。6）PCR固相分析法：可用于基因芯片的制作7）原位PCR：直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。8）逆转录PCR：主要检测mRNA的表达水平，通过逆转录可以得到我们想要的目的基因，为下一步研究做准备。9）荧光定量PCR: Realtime PCR 常用的两种方法分别为：Sybr green（荧光染料掺入法）和Taqman probe（探针法）SYBR green 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。此方法适用：a.灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上 b.通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。 c.通用型方法，在国内外科研中普遍使用。 d.高通量大规模的定量PCR检测 e.专一性要求不高的定量PCR检测。 Taqman Probe PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 此方法适用：a.具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。 b.适用于扩增序列专一的体系的检测。 c.样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。 d.靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。 e.存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。 f.广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定。3.Sanger双脱氧终止法测序的原理DNA链末端合成终止法Sanger法，原理：（1）单链DNA模板与寡核苷酸引物杂交，新的DNA链在DNA聚合酶催化下从引物末端进行合成。在反应混合物中除了有模板DNA、引物、DNA聚合酶和4种底物dNTPs之外，还加入一定比例的四种2,3-双脱氧核苷三磷酸ddNTPs(终止核苷)之一。例如，加入ddATP，则所得到的合成物产生一系列嵌套的DNA片段，通过荧光标记替代发现其中每一个片段终止于序列的A碱基对。对其他三种碱基，采用同样的方法，但需要不同的荧光标记。（2）所有标记的DNA片段混合物经过电泳分离大小不同的片段，并对这四种标记的片段进行扫描。然后通过某一程序判断条码的顺序并预测序列。4.大规模基因组测序的两种策略逐步克隆法全基因组霰弹法完整基因组的测序过程一般包括三个步骤：1).建立克隆的物理图谱，如酵母人工染色体YAC（Yeast Artificial Chromosome）克隆、细菌人工染色体BAC（Bacterial Artificial Chromosome）克隆等；2).利用鸟枪法（Shotgun Strategy）测定每个克隆的序列；3).序列拼装和注释。当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、重复区域等，进而对序列的生物学特性进行注释。BAC文库指细菌人工染色体(BAC)文库，直接用途是大片段DNA在基因组上定位。两种大规模基因组测序策略的比较四、1.概念：限制性内切酶：能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。切割不同来源的DNA分子，而产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。存在于细菌体内。（限制性核酸内切酶与外切酶的区别：凡能从多核苷酸链的末端开始水解核酸的酶称为核酸外切酶，凡能从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶称为核酸内切酶。而能识别特定的核苷酸顺序,并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）。）2.应用这些酶的要求：1).尽可能使用能在相应时间内获得完全酶解的最少酶量；2).减少反应体系中甘油的含量；3).除Mg2+外不加其他重金属离子；4).适当提高反应系统的离子强度；5).尽可能除去反应系统中可能存在的有机溶剂，如沉淀DNA用的乙醇。3.为什么说限制性内切酶被誉为分子生物学家的手术刀，结合第1、2章所学内容，论述其在基因工程中的意义？限制性核酸内切酶主要从细菌中获得，由于性质上的差异，现在把它们分为三型：I类：系复合功能酶，即对双链DNA有切割、甲基化、解旋的活性。不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。类：基因工程的工具酶。类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点25bp27b