第1课时大肠杆菌的培养和分离知识内容要求考情解读大肠杆菌的培养和分离掌握程度参考实验与探究能力1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。一、微生物培养的基本条件1微生物(1)特点：结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。(2)分类(3)用途：许多种抗生素来源于放线菌和霉菌；酒由酵母发酵产生；腐乳由红曲霉和毛霉发酵制成；微生物能用于治理环境污染，在新能源领域也将发挥巨大作用。2培养基(1)概念：培养基是微生物生存的环境和营养物质。(2)分类：培养基按物理性质常可分为固体培养基和液体培养基，一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四类营养物质，另外还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质和氧气的要求。通常细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定量的氯化钠以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。(3)酸碱性：细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长，霉菌要求在中性偏酸的环境中生长；因此，在制备培养基时需调节培养基的酸碱度。特别提醒有关培养微生物所需营养的三点提醒(1)不同微生物对营养的需求不同，所以培养不同的微生物所需要的营养可能不同。(2)对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机物既是碳源又是氮源、能源。(3)培养微生物时营养物质要协调。营养物质过少不能满足微生物的营养需要，过多对微生物的生长有抑制作用。3灭菌操作(1)常见灭菌方法对于培养皿、试管、三角瓶、镊子等常采用高压蒸汽灭菌法灭菌。对于不能加热灭菌的化合物，如尿素等，只能用G6玻璃砂漏斗过滤，但玻璃砂漏斗使用前也要在121 下用纸包好灭菌。实验操作过程中，一般采用灼烧的方法对接种环进行灭菌。(2)高压蒸汽灭菌操作的要求灭菌前各种用品均需用牛皮纸或报纸包好，在121 下灭菌15 min，实验过程中不能用脱脂棉，因为其易吸水，吸水后容易引起污染。如培养基中有葡萄糖，为防止其分解碳化，要用500 g/cm2压力(90 以上)灭菌30 min。探究1图示解读结合所学知识，完成下图横线上大肠杆菌的结构名称，然后思考：1大肠杆菌与酵母菌相比，在结构上最主要的区别是什么？答案大肠杆菌是原核生物，与酵母菌相比，最主要的区别是没有由核膜包被的细胞核。2大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌，在肠道中一般对人无害，但也有一些菌株对人体是有害的，可以侵袭肠黏膜并产生毒素。但是，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。3应用：大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具。探究2归纳概括1培养基的成分营养物质定义作用主要来源碳源能提供碳元素的物质构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些也是异养生物的能源物质无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、石油等氮源能提供氮元素的物质合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物无机氮源：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子生长必不可少的微量有机物质是酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等水代谢必需的无机物参与新陈代谢、良好溶剂外界摄入无机盐为生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素是细胞组成成分，生理调节物质、某些化能自养菌的能源、酶的激活剂等无机化合物2.培养基的类型划分标准培养基种类特点用途按物理状态液体培养基不加凝固剂扩大培养或工业生产半固体培养基加少量凝固剂而呈半固体状态观察微生物的运动、分类鉴定固体培养基加入凝固剂，如琼脂、明胶、硅胶等微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种按功能选择培养基允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长培养分离特定的微生物鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物按化学成分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基的成分已明确分类、鉴别探究3比较异同1比较消毒和灭菌的不同之处项目消毒灭菌理化因素的作用强度较为温和强烈常用方法煮沸消毒、化学药剂消毒、紫外线消毒灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌消灭微生物的数量部分生活状态的微生物全部微生物芽孢和孢子能否被消灭不能能2几种消毒和灭菌方法及其适用范围类型适用范围操作方法消毒方法煮沸消毒法日常生活100 煮沸56 min巴氏消毒法不耐高温的液体7075 煮30 min或80 煮15 min化学药剂生物活体、水源等擦拭等，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线房间、仪器设备紫外线照射30 min灭菌方法灼烧接种工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱，160170 加热12 h高压蒸汽灭菌培养基、培养皿等，生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内，100 kPa，温度121 ，15 min过滤不耐高温的物质，如尿素、酶等G6玻璃砂漏斗过滤易混易错(1)灭菌与消毒的原理是相同的，仅仅是作用的条件不同，抑菌和灭菌的程度不同。(2)对培养基pH的调节，需在灭菌之前进行。例1(2017绍兴高二月考)下列有关大肠杆菌的叙述，正确的是()A大肠杆菌细胞内的DNA全部位于拟核区B大肠杆菌是原核生物，属于兼性厌氧菌C大肠杆菌的细胞壁与植物细胞的细胞壁的结构、功能非常相近D大肠杆菌对人类无害答案B解析大肠杆菌是原核生物，属于兼性厌氧菌，B项正确；大肠杆菌的小型环状DNA分子(质粒)位于细胞质中，A项错误；大肠杆菌的细胞壁的成分和功能与植物细胞的细胞壁不同，C项错误；任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害，D项错误。例2(2017温州高二检测)下列关于灭菌的叙述，正确的是()A用于细菌等微生物培养的培养基都必须用高压蒸汽灭菌锅灭菌B锥形瓶、培养皿、移液管等器具的高压蒸汽灭菌时间一般为15 min(121 条件下)C超净工作台或接种箱用紫外灯灭菌30 min即可D灭菌后的培养基、器具就已经达到了完全无菌答案B解析培养基通常可以进行高压蒸汽灭菌，若培养基中有碳酸氢钠、尿素等高温易分解的成分，就不能用此方法，A项错误；超净工作台或接种箱用紫外灯灭菌30 min，同时还需打开过滤风，C项错误；灭菌后的培养基、器具不一定达到了完全无菌，而且要防止二次污染，D项错误。方法技巧三种常用灭菌方法的比较灭菌方法适用材料或用具灭菌条件灭菌时间灭菌后处理高压蒸汽灭菌培养基、玻璃器皿等121 ，1 kg/cm2压力(若培养基中含有葡萄糖，为防止其碳化，90 以上，500 g/cm2压力)15 min(若含有葡萄糖，灭菌时间30 min)实验用具在6080 烘箱中烘干；培养基冷却待用灼烧灭菌接种环、接种针或其他金属用具；玻璃刮刀在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧烧红(或玻璃刮刀上的酒精燃尽)防止过热杀死目的菌种，冷却后使用过滤灭菌不能加热灭菌的化合物，如尿素培养基等G6玻璃砂漏斗过滤尿素滤液过滤完毕玻璃砂漏斗用1 mol/L的HCl浸泡，抽滤去酸后蒸馏水洗至中性，干燥后保存二、细菌的培养与分离1细菌的培养(1)繁殖方式：细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20 min分裂一次。(2)人们在培养细菌时，需要将已有细菌的培养物转移到新的培养基中，一般用接种环转移带菌的培养物。大肠杆菌的培养和分离实验中采用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌。2细菌的分离方法(1)划线分离法：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作。由于划线过程中，接种环上的菌液逐渐减少，因此划线最后部分的细菌间距离加大，经过培养可获得单菌落。(2)涂布分离法：用此法分离时，需要先将培养的菌液稀释，通常稀释105107倍。取0.1 mL稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上，然后进行培养。通常以每个培养皿中有20个以内的单菌落最为合适。(3)两种分离法的比较：划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。3大肠杆菌的培养和分离(1)实验内容：将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上就会形成一个个单独的菌落。(2)实验步骤培养基灭菌倒平板接种划线分离培养观察菌种保存将50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌将培养基分别倒入4个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养12 h用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿将培养皿倒置(盖在下面)，放在37 恒温培养箱中培养1224 h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 培养24 h后，置于4 冰箱中保存。探究1图示解读固体培养基经高压蒸汽灭菌后，待培养基冷却到60 时，需搁置斜面(图甲)或倒平板(图乙)，请回答下列问题：1如何确定制备的培养基灭菌是否合格？答案将未接种的培养基在适宜的温度下放置一定时间，观察培养基上是否有菌产生。2在固体培养基凝固前搁置斜面的目的是什么？答案增大接种面积。3平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答案平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4观察甲、乙、丙、丁四幅图，熟悉倒平板的操作流程，请填空：(1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙乙甲丁。(2)甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。(3)丁中的操作需要等待平板冷却凝固才能进行。探究2科学探究1平板划线及培养结果接种环在固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐步分散到培养基的表面。下图为平板划线示意图(A)及培养后菌落分布示意图(B)。(1)A图中a(填图中序号)区域为起始处，在图中b(填图中字母)区域更易获得单菌落。(2)下图中甲为划线分离法中最重要的环节，乙为操作的结果，判断下列正误。每一次划线后都要将接种环灼烧()除第一次划线外，每一次划线的起点都是第一次划线的末端()2划线分离的注意事项(1)第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环。(2)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。(3)划线时，只能蘸取一次菌液，每次划线以上次划线的末端为起点，划线最后一区不要与第一区相连。(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。思维拓展划线分离过程中每次灼烧接种环的目的不同