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各种酶活性测定方法第一 超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂(一)材料;水稻或小麦叶片(二)仪器设备:1.高速台式离心机;2.分光光度计;3.微量进样器;4.荧光灯(反应试管处照度为4000Lx);5.试管或指形管数支。(三)试剂1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH7.8);2. 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液:称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml;3.750mol/L 氮蓝四唑溶液:称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存;4. 100mol/L EDTANa2溶液:称取0.03721gEDTANa2用磷酸缓冲液定容至1000ml;5. 20mol/L 核黄素溶液:称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉)0.5g于预冷的研钵中,1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml。取1.52ml于1000rpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液。2. 显色反应取5ml指形管(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液:试剂(酶)用量(ml)终浓度(比色时)0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750mol/L NBT溶液0.375mol/L 100mol/L EDTANa2液0.310mol/L 20mol/L 核黄素0.320mol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000Lx日光下反应20min(要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长)。3. SOD活性测定与计算至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性。SOD总活性(AckAE)V/(Ack0.5WVt)上式中,SOD比活力SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示;比活力单位以酶单位mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积(ml)Vt测定时样品用量(ml)W样鲜重(g)蛋白质含量单位为:mg蛋白g鲜重。SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法缩写:SOD:超氧化物歧化酶; CAT:过氧化氢酶; POD:过氧化物酶; MDA:丙二醛;PVP:聚乙烯吡咯烷铜K-30;L-Met:甲硫氨酸;NBT:氮蓝四唑;TBA:硫代巴比妥酸;TCA:三氯乙酸;PBS: 磷酸缓冲液1. SOD的测定方法加样顺序:(V=3ml)磷酸缓冲液:1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3mlEDTA-Na2: 0.3ml 核黄素:0.3ml 酶液:0.05ml 蒸馏水:0.25ml试剂配制:(1) 0.05mol/L PBS:pH7.8(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml(5) 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存)注:(1)对照:以加缓冲液、不照光为空白;照光的为最大还原管(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制:(1)5% TCA: 5g用蒸馏水定容至500ml(2)0.5% TBA:2.5g用TCA定容至500ml方法:酶液1ml3ml0.5%TBA和5%TCA混合后在100度水浴煮沸15min迅速冷却,10000r/min离心10min用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制:(1)0.1mol/L的醋酸缓冲液:8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液 A(0.2mmol/L的HAc溶液)6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中 B(0.2mmol/L的NaAc溶液)13.6gNaAc.3H2O(2)0.25%愈创木酚溶液125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中(临用前配制)(3)0.75%H2O2溶液:1.25ml 30% H2O2定容至50ml(临用前配制)方法:比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液1ml 0.25%愈创木酚溶液xml酶液(5min值为500-800即可)0.1ml 0.75%H2O2溶液迅速巅到混匀把A460调零并开始计时1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制:(1) 50mmol/L的PBS(pH7.0) (2) 0.3% H2O21ml H2O2定容至100ml方法:(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS(pH7.0)为空白把A240调零(2)50ul酶液3ml 50mmol/L的PBS(pH7.0)0.2ml 0.3% H2O2迅速颠倒混匀,开始计时1min后在240nm下比色,1次/1min(连续读取5min)。2010年06月22日 星期二 19:331 叶绿素含量测定:80的丙酮液的配制:4L丙酮 + 1L蒸馏水。称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管(做三个重复),加入25ml浓度为80的丙酮液,放在黑暗处浸提大约36小时后取出,稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度,以80的丙酮液为空白。(参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导,P3536)也可用95%乙醇溶液,在665、649、470nm处有最大吸收峰Ca=13.95D665-6.8649Cb=24.96D649-7.32D665Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/2452 抗氧化酶活性的定:(2.5g样)0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)(pH=7.8)溶液的配制:65.5506g Na2HPO412H2O + 2.65285g NaH2PO42H2O, 定容到4L。(参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导,P134)。取低温保存的鲜样,称2g左右的叶片(或根)放在50ml的离心管,加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液(pH=7.8)(最好是较冷的磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶失活),研磨(用磨碎机磨),8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为粗酶液。2.1丙二醛(MDA)的测定:20三氯乙酸(TCA)溶液的配制:称200g三氯乙酸,用蒸馏水定容到1000ml。(参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124);0.5% 硫代巴比妥酸(TBA)溶液的配制:称5g硫代巴比妥酸(TBA),用20三氯乙酸(TCA)溶液溶解并定容到1000ml。(参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124)(先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解);0.5ml酶液(对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液)(做三个重复)+ 3mlTBA振荡沸水浴上反应30min冷却(至少30min)比色(OD600、OD532、OD450)。(参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124)2.2超氧化物歧化酶(SOD)的测定:NBT(400ml)混合反应液:392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液(100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素)。(另配)100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时:取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液,于光照培养箱中6-10分钟,OD650下测定吸光度。2.3过氧化物酶(POD)的测定:0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)(pH=7.0)溶液的配制:10.9251g Na2HPO412H2O + 3.042975g NaH2PO42H2O,定容到1000ml。0.3%H2O2溶液的配制:吸2.5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。0.2%愈创木酚溶液的配制:称0.5g愈创木酚,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml?(原来为0.01)酶液(根加0.05ml酶液)(对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液)(做三个重复),记录470nm处OD降低速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。(参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导P121)比色时加酶液,混合后即刻计时。2.4 脯氨酸的测定标准曲线的制作:编号1234567标准脯氨酸的量(ml)00.10.20.40.60.81.0H2O(ml)1.00.90.80.60.40.20冰乙酸(ml)2222222显色液(ml)3333333脯氨酸含量(l)012468100.5ml酶液(对照用0.5ml 80乙醇代替)(做三个重复) + 1ml冰乙酸 + 1.5ml显色液混匀,沸水浴15min,冷却后测OD520。2.5可溶性蛋白的测定(参考赵志杰,史国安,董新纯编的植物生理学实验指导)牛血清白蛋白:配成100g/ml和1000g/ml。90乙醇:90ml乙醇 + 10ml蒸馏水。? 85(W/V)磷酸:170ml磷酸 + 30ml蒸馏水。考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90乙醇中,加入85(W/V)磷酸200ml,用蒸馏水定容到2L。常温下可保存一个月。标准曲线的制作:配制0100g/ml血清白蛋白血液管号123456100g/ml牛血清白蛋白(ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水量(ml)1.00.80.60.40.20蛋白质含量(ml)00.020.040.060.080.10配制01000g/ml血清白蛋白血液管号7
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