附录：常用试剂配制及应用一、常用缓冲液、试剂的配制碳酸盐缓冲液(Carbonate-Bicarbonate Buffer)由于碳酸盐pH值偏碱，因此，常用于pH9的缓冲液配制（附表1）。附表1. 0.2 mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.210.7）pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3 (ml)pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3 (ml)9.24.046.010.027.522.59.37.542.510.130.020.09.49.540.510.233.017.09.513.037.010.335.514.59.616.034.010.438.511.59.719.530.510.540.59.59.822.028.010.642.57.59.925.025.010.745.05.0磷酸缓冲液(Phosphate Buffers，PB) 磷酸盐是使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个pKa 值，所以用它们配制的缓冲液，pH 范围最宽。NaH2PO4：pKa12.12，pKa27.21； Na2HPO4：pKa17.21，pKa212.32。另外，磷酸盐还有钾盐分子形式，一般来说，低温时钠盐难溶，钾盐易溶，因此，配制细胞培养用试剂时常常添加钾盐试剂，但若配制十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用钠盐而不能用钾盐，因为SDS会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。磷酸缓冲液的优点为：可配制成不同离子强度的缓冲液；适用pH缓冲范围较宽；受温度影响缓冲液pH值变化较小；离子强度对缓冲液pH影响较小，如0.1mol/L缓冲液稀释10倍其pH变化小于0.1。磷酸缓冲液的缺点是：磷酸盐易与钙离子（Ca2+）、镁离子（Mg2+）及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；可能干扰某些化学反应过程，如对某些酶的催化活性具有一定程度的抑制作用。NaH2PO4的pH值偏酸性，可用作pH10的缓冲液。而pH68的中性缓冲液是更常用的缓冲液，需要NaH2PO4与Na2HPO4两种磷酸盐混合配制（附表2）。附表2. 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.78.2）pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2H PO4 (ml)pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2H PO4 (ml)5.793.56.57.039.061.05.892.08.07.133.067.05.990.010.07.228.072.06.087.712.37.323.077.06.185.015.07.419.081.06.281.518.57.516.084.06.377.522.57.613.087.06.473.526.57.710.589.56.568.531.57.88.591.56.662.537.57.97.093.06.756.543.58.05.394.76.851.049.08.14.295.86.945.055.08.23.097.0磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-buffered saline, PBS)磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，PBS适用于做细胞缓冲液，常用PBS配制如下。NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g在800ml蒸馏水中溶解，用HCl调节溶液的pH值至7.27.4加水定容至1L，15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌20min，室温保存备用。Tris缓冲液（Tris-HCl Buffer, TB）Tris的pH值偏于碱性，因此，通过添加HCl调节pH至所需值，Tris-HCl缓冲液的离子强度（mol/L）是专指Tris的浓度，如某一特定pH的0.05 mol/L Tris缓冲液的配制是将50ml 0.1 mol/L Tris碱溶液与附表3所示相应体积（ml）的0.1 mol/L HCl混合，加水至将体积100ml，即为0.05 mol/L Tris缓冲液。另外，按附表3制备的缓冲液，由于试剂来源的不同，缓冲液pH可能与所需略有差异，此时可通过稍许减少或增加HCl用量，精细调节pH至所需值。附表4. 0.05 mol/L Tris缓冲液pH需0.1 mol/L HCl（ml)pH需0.1 mol/L HCl（ml)7.145.78.126.27.244.78.222.97.343.48.319.17.442.08.417.27.540.38.514.77.638.58.612.47.736.68.710.37.834.58.88.57.932.08.97.08.029.2Tris盐缓冲液（TBS）：Tris盐缓冲液是在Tris缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，TBS也适用于做细胞缓冲液，常用TBS配制如下。8g NaCl、0.2g KCl以及3g Tris溶解于800ml蒸馏水中，加入0.015g酚红并用HCl调pH至7.4用蒸馏水定容至1L，分装后在15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌20min，室温保存。现在常用Tris盐缓冲液通常不加pH指示剂，而且该溶液如果不用于细胞培养，通常不加KCl及酚红。Hanks液 (Hanks Balanced Salt Solution)Hanks液是一种平衡盐溶液，主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗等。贮存液A液：(I)NaCl 80g KCl 4g MgSO47H2O 1gMgCl26H2O 1g用双蒸馏水定容至450ml。(II)CaCl2 1.4g (或CaCl22H2O 1.85g)用双蒸馏水定容至50ml。将I和II液混合，即成A液。贮存液B液：Na2HPO412H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g, 酚红 0.2g, 葡萄糖 10.0g, 酚红应先置研钵内磨细，然后按配方顺序一一溶解，用双蒸馏水定容至500ml。 (3)应用液：A、B储存液分别经112.6湿热灭菌20min，取A和B液各25ml，加无菌双蒸馏水至450ml，使用前用无菌的3.5%或5.6% NaHCO3调至所需pH。注意：药品必须全部用A.R试剂，并按配方顺序加入，用适量双蒸水溶解，待前一种药品完全溶解后再加入后一种药品，最后补足水到总量。无Ca2+、Mg2+ Hanks液（Hanks Solution without calcium, magnesium sulfate）NaCl 80g, KCl 4g, Na2HPO412H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g,葡萄糖 10g,用双蒸馏水溶解后，加入0.4酚红溶液50ml，再加入双蒸水至1000ml，112.6湿热灭菌20min，4 冰箱保存。临用前将原液用无菌双蒸水作1：10倍稀释，用无菌的3.5%或5.6% NaHCO3调至所需pH。pH7.2柠檬酸盐缓冲液(Citrate Buffer)柠檬酸 0.327g柠檬酸钠 2.63g磷酸氢钠 0.222葡萄糖 0.00255mg蒸馏水加至100ml。pH3.3枸橼酸-磷酸盐缓冲液（Citric acid- Phosphate Buffer) 0.131mol/L citrate acid，0.066mol/L Na2HPO4，等量混合，调节pH至3.3。0.5 mol/L EDTA, pH 8.0EDTA2H2O 186.1 gNaOH 20 g将EDTA2H2O加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用NaOH调节pH至8.0，EDTA直到接近pH 8.0才完全溶解，定容至1L。分装后高压蒸汽灭菌。0.4%酚红溶液取酚红0.4g置于研钵中逐滴加入1mol/L NaOH溶液11.28ml，边研磨边使酚红转变为钠盐溶于水中，加双蒸水至100ml，过滤后，4 冰箱保存。醋酸钾（Potassium Acetate） 在60ml 5mol/L醋酸钾溶液中，加入11.5ml冰醋酸和28.5ml水。该溶液用于碱性裂解。3mol/L 醋酸钠（Sodium Acetate），pH5.2和pH7.0 在800ml水中溶解408.1g三水醋酸钠，用冰乙酸调pH至5.2或用稀释乙酸调pH至7.0，加双蒸水至1L。分装后高压灭菌。柠檬酸钠缓冲液(Sodium Citrate Buffer) 柠檬酸钠 1.8g HCl(1mol) 4ml 无水乙醇 95ml 先用100ml去离子水溶解柠檬酸钠，然后加入HCl和无水乙醇，再补充去离子水至总量200ml。饱合硫酸铵溶液(Saturated Ammonium Sulfate Solution) 取500ml双蒸馏水，加入约400克硫酸铵，水浴加热至70，磁力搅拌器充分搅拌，直到加入的硫酸铵不再溶解，以氨水（也可用NaOH）调pH7.2，室温保存。二、酶免疫检测常用试剂配制包被液(Coating Buffer)（pH9.5碳酸盐缓冲液）Na2CO310H2O 8.58g NaHCO3 5.8g 溶于双蒸水至1000ml。封闭液(Confining liquid)（5%脱脂乳-PBS溶液，pH7.4）脱脂乳 50g加0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）至1000ml溶解。洗液(washing liquid) 氯化钠 8.0g 磷酸二氢钾 0.2g 磷酸氢二钠（12H2O） 2.9g 吐温-20 0.5ml 加去离子水至1000