安徽医学高等专科学校毕业论文重组人胰岛素制备工艺中大肠杆菌破碎方法选择Recombinant human insulin production process E. coli broken method choice毕业生： * 指导教师： * 专业名称： 药学 二零一二年四月1摘要重组人胰岛素的生产，目前通过重组基因工程菌的发酵，以菌体的代谢，来合成人胰岛素1。所应用的工程菌种一般是大肠杆菌类，其目标蛋白在胞内表达，形成包涵体。一般生产工艺流程是通过目标基因的提取，制备工程菌，通过发酵扩大培养（形成大量的菌体），再通过浓缩，洗菌，破碎，复性，纯化，结晶，再结晶，冻干，收集晶体等步骤。其中菌体破碎是提取胞内产物的关键性步骤。其破碎率的大小，将直接影响一下工艺中的最终胰岛蛋白的得率。所以，提高菌体破碎率，将会提高包涵体的收集，有利于提高胰岛素的得率。大肠杆菌再生产过程中，由于其质粒引入的人胰岛素基因是外援基因，且大肠杆菌是原核生物，目标蛋白是胞内表达，并形成水不溶性的包涵体。细胞破碎的目的是释放出细胞内含物（包涵体），其方法很多，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法。机械法（高压匀浆器、高速珠磨机、超生波振荡器等）；非机械法（酶解法、渗透压冲击法、冻结-融化法、化学法等）。机械法需要专用设备，利用机械的作用将细胞切碎，所以细胞碎片细小、胞内物质一般都会释放出来。因此，造成细胞浆液中的核酸、杂蛋白含量较高，料液黏度大；但是，设备的通用性较强，破碎效率高，操作时间短，成本低，大多数的机械破碎法都适合大规模工业化生产。非机械法通过化学试剂或物理变化等因素来破坏细胞壁或其通透性的。破菌的条件比较温和，细胞的破碎率较低，胞内物释放的选择性好，固液分离容易，但耗费时间长，某些方法成本比较高，而且操作较为复杂。关键词：菌体破碎，机械法与非机械法2文献综述：2.1工程菌种概况大肠杆菌通过基因工程，由人体细胞DNA中提取人胰岛素基因，与细菌中质粒结合后，重新导入细菌中形成一种能够是目标基因表达而产生人胰岛素蛋白的菌种，这类菌被称为工程菌。工程菌在发酵扩大培养时，由于其目的基因上有阻遏基因，产生阻遏蛋白，是目的基因无法表达，因此在没有诱导物的时候，菌体几乎不表达。为了获得目标产物，人们使用乳糖或者IPTG等诱导物进行诱导菌体，目标基因大量表达才能大量表达，形成包涵体，因为在大肠杆菌中表达的真核基因产物往往都以包涵体形式存在于大肠杆菌浆液中2，所以要进行菌体破碎，才能获得包涵体。包涵体形成的原因：研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体3。所形成的包涵体可能是因为蛋白合成过快，以至于没有足够的时间进行有效的空间折叠，无法形成有活性的蛋白。重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，真核蛋白无法糖基化使中间体溶解度下降，导致不溶解包涵体形成。有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体4。工程菌大肠杆菌的细胞壁：大肠杆菌是革兰氏阴性菌，其细胞壁位于菌体最外层，厚约11um，分为两层，即外膜和肽聚糖层。外膜是大肠杆菌细胞壁的主要成分，占细胞壁于重的80，厚约8nm，位于肽聚糖层的外侧，主要由磷脂、蛋白质和脂多糖组成。肽聚糖层较薄，约23nm，占细胞壁成分的10%左右，肽聚糖之间仅由四肽侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，且肽聚糖居于细胞壁最内层，紧贴于细胞膜上5。细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于多糖链上所存在的肽键数量和其交联的程度。交联程度越大，网状结构就越致密，破碎的难度也就越大。2.2破碎方法介绍与分析（细胞破碎的方法可分为两种：即机械法和非机械法）2.2.1机械法：高压匀浆器（high pressure homogenizer），高压匀浆器是常用的破碎装置。其工作原理：高压匀浆器又名高压匀浆机、高压均化机、高压乳化泵。它是一种用途广泛的破碎、乳化设备。高压匀浆器一般有一个或几个往复运动的柱塞。一半多柱塞的往复泵其一对一的对应各自的工作室，个工作室互不相连，但进料管和排料管相通。个工作室并联在一起，做往复运动。依靠着柱塞的运动的配合，各单向阀门把处理的物料吸入泵腔内进行高压压缩。一般最高可达10000KgCM2，这些被压缩的物料经过一个或几个可调节的限制阀口，以很高的线速度由阀口喷出。撞击在特殊材料制成的圆环上，产生了三种效应：第一是空穴效应，被柱塞压缩的料液高压物料的内部产生了很大的能量，料液通过阀口时，突然失压，物料内部的巨大能量被释放出来，形成气泡，引起空穴爆炸，形成空穴效应；第二是碰撞效应，通过阀口的物料有极高的流速，这些高速喷射的物料将会强烈的撞击在一个坚硬的圆环上，产生破碎；第三个效应是剪切效应，物料通过泵腔内的通道和阀口的狭缝时会产生剪切效应，另外由于混悬液各流层之间的流速不同，各层之间还会产生内部的剪切。通过这三种效应，高压匀浆器能使物料达到很高的破碎率。影响高压匀浆器破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器的次数。一般来说，增大压力和增加破碎次数都可以提高破碎率，但当压力增大到一定程度后对匀浆器的磨损较大。Brokman等人6已研究了能适应于高压操作的匀浆阀，试验表明在约175Mpa的压力下，破碎率可达100%，但也有试验表明，当压力超过一定值后，破碎率的增加很慢7。工业生产中，通常采用的压力5570Mpa。高压匀浆器适用范围广，可以在大规模处理料液时采用；细化作用强烈，且细化作用是利用了物料间的相互作用，物料间的发热量较小。因而，可以维持一些成分的性能基本不变；高压匀浆器是通过往复泵送料，在正常运行中能够定量的输送物料；噪音一般较小；高压匀浆器耗能较大；高压匀浆器的阀件、密封件、柱塞等较易损毁；高压匀浆器不适合用于黏度很高的料液处理；一些交易造成团状或丝状的真菌，以及较小的革兰氏阳性菌不适于用高压匀浆器处理；高压匀浆器的运行参数少，易于确定，而且物料损失量少，最少可处理20ml悬浮液8。高速珠磨机（high speed bead mill），高速珠磨机又称砂磨机高速珠磨机的工作原理：珠磨机的罐体是由不锈钢或陶瓷材料做成的，珠磨机的整个工作是在珠磨机罐体内进行的。它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂混合在仪器，密封在珠磨机的罐体内。一方面，珠磨机的磨介质随着罐体的搅拌轴旋转而被带到一定的高度，介质由于受到自身的重力而下落，装在罐体里的料液会受到介质猛烈地冲击力；另一方面，随着磨介质在罐体内沿着罐体轴心的快速转动，在磨介质之间以及与罐体之间对物料产生的摩擦力，从而将物料中的细胞磨碎。另外，在料液的出口处，旋转圆盘和出口平板的缝隙很小，可以阻挡磨介质被物料带出。由于操作过程中会产生热量，易造成某些有效成分的破坏，故磨室内还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和磨介质。高速珠磨机主要包括：三辊珠磨机，篮式珠磨机，立式珠磨机和卧式珠磨机。Schutte等9人报道了在面包酵母菌破碎中，表明提高搅拌速度、增加小珠数量、降低酵母悬浮液的浓度和通过珠磨室的循环速度均可增大破碎效率。但在实际操作时，各种参数变化必须适当，过大的增加搅拌转速和增加小珠的数量均会造成耗能增大，磨室温度升高较快。Currie等人10报道操作温度在540范围内对破碎物影响较小，但是在操作过程中珠磨室的温度很容易升高，较小的设备可以考虑采用冷却夹套来调节磨室温度，大型设备中热量的出去是必须考虑的一个主要的问题。珠磨机适用范围广，可以大规模生产；细胞的破碎率可以通过提高搅拌速度、增加珠磨介质的数量、延长物料在珠磨机罐体停留时间而使破碎率增加。实际生产过程中搅拌速度加快和珠磨介质的数量增加会使温度迅速升高，因此在大型设备中热量的出去是一个关键性的问题。物料是在密封条件下进行粉碎的，因此可以进行无菌粉碎，另外可以保证一些溶剂不会挥发，造成环境污染，和人体伤害；珠磨机操作参数较多，一般很难于控制，一般凭经验估计，而且在处理菌液时，珠子之间的液体损失使一次处理85ml悬浮液最终只能得到50ml左右的浆液；在连续生产中，珠磨机具有高压匀浆器不具备的优越性，珠磨机兼备着破碎和冷却作用，减少了产物的失活性11。几乎所有种类的微生物细胞都可以用珠磨机破碎；当目标产物是大分子时失活损失增加；细胞碎片较小，分离碎片不易，给下一步操作带来困难。超生波振荡器 超声波具有频率高、波长短、定向传播等特点。其可分为槽式和探头直接插入介质式，一般破碎效果后者比前者好。超声波振荡器是由于其发出的超声波在液体中形成空穴，在某一小区域交替重复地产生巨大的压力和拉力。由于拉力的作用，产生了一个强烈的冲击波压力，从而使周围粘滞性漩涡在悬浮细胞上造成剪切力，从而产生细胞破碎。有12实验表明：超声波破碎在试验条件下，选用10变幅杆，大肠杆菌菌液浓度在50亿ml，工作5s、休息5s的运行模式连续处理30min其破碎率可达99.9%；而反复冻融破碎，无论液氮的低温冷冻人为速溶或自溶，还是采取冷冻箱的动容，达到50%以上的破碎，要耗时数小时，且还要经过预冷冻的过程。因此与反复冻融法相比，利用超声波破碎大肠杆菌目前认为是比较理想的方法之一。超声波处理法所需时间较短，成本较低。与酶解等法相比，不需加昂贵的酶类。但是与高压匀浆器相比，它的噪音比较大，应用于大规模工业化时，其破碎菌体效率会因菌体的体积变大以及菌体的浓度变大而使声能不能有良好的传递使菌体不能达到很好的破碎；如果在加大超声波功率的时，由空化作用产生的热难以散去等诸多因素的影响，以至于超声波破碎菌体试验多数只用于实验室，很少在大规模生产中运用。2.2.2非机械法：酶解法酶解法是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而使细菌破碎。酶解作用需要有适宜的酶和酶系统，并要控制特定的反应条件，有些微生物体可能仅在生长的某一阶段或生长处于特定的情况下，才对酶灵敏；有些微生物还需要附加其他处理，如辐射、渗透压冲击、反复冻融等。酶解法具有很强的专一性，在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。溶菌酶能专一性的分解细胞壁上的肽聚糖分子的-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类的细胞裂解。另外，对于革兰氏阴性菌单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用，原因是因为革兰氏阴性菌结构中肽聚糖含量较少，并处于细胞壁内层，外表面含有大量的脂类（脂蛋白、脂多糖），而脂多糖层需钙、镁离子才能维持稳定性。，EDTA可以除去钙、镁离子，使脂多糖分子脱落，外层膜出现洞穴，溶菌酶才能发挥作用5。酶解法的优点是发生条件温和、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量较少、细胞外形较完整、便于后步分离；酶水解价格较高，故在小规模应用较广。渗透压冲击法 渗透压冲击法师一种较温和的破碎方法。是将细胞放在高渗透压的溶液中，由于渗透压的作用，细胞内水分向外渗出，细胞向内收缩，一段时间后，将介质快速稀释或将细胞转入水中或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速的渗入细胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。渗透压冲击法是一种较温和的破碎方法，不会出现菌体细胞全破碎而造成杂质过多。渗透压冲击法仅对一些较脆弱的细胞壁有效；或者先将细胞壁用酶处理再用渗透压冲击法。冻结-融化法是一种将细胞放在低温下冷冻，然后在室温中融化或人为融化，反复多次而达到破壁作用。有冰箱冷冻破碎法、液氮冷冻破碎法等。由于冷冻，一方面能使细胞的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面，胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞涨破而裂解。一般，该法仅用于细胞比较脆弱的细菌。这种方法破碎菌体的效率很低，即使反复多次也很难提高收率，还有可能造成某些敏感的