目录微生物培养1培养基2土壤分解纤维素细菌的分离稀释涂布3平板划线法5植物细胞工程进阶7植物细胞工程7植物细胞工程的应用8动物细胞工程进阶10干细胞概念介绍10动物细胞培养11胚胎工程进阶13胚胎工程的理论基础13【第二节】胚胎工程技术及其应用14【第三节】动物细胞核移植16基因工程118基因工程的工具概述18限制酶的选取原则19酶切片段种类分析20基因工程221基因工程的基本过程（一）目的基因的筛选与选取21基因工程的基本过程（二）重组载体构建导入及筛选22基因工程的基本过程（三）目的基因的检测与鉴定24PCR及基因工程应用26PCR和电泳技术26基因工程的应用28蛋白质工程的一般过程29微生物培养纤维素构成植物细胞壁的主要成分，在自然界中大量存在，人类缺乏分解纤维素的肠道微生物无法直接利用纤维素，如果能够利用高效的微生物分解纤维素产生葡萄糖供人类利用，可以极大的缓解粮食问题和环境问题。那么思考下列问题：1. 土壤是微生物的大本营，哪种土壤适合用于分离纤维素分解菌？2. 利用土壤样品分离的过程怎么保证只培养纤维素分解菌而不培养其他微生物？3. 纤维素分解菌怎么鉴定？如何判断分解效率？4. 低温保存后再利用时用什么方法可以得到单菌落？培养基1. 培养基：为人工培养微生物而制备，适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物营养基质。2. 培养基的成分 各种培养基的配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等最基本的物质。配制固定培养基的时候一般会加凝固剂，琼脂是常用的凝固剂。 3. 培养基的分类a) 物理状态b) 成分了解程度 c) 功能 4. 无菌技术 土壤分解纤维素细菌的分离稀释涂布1. 以纤维素为唯一碳源的培养基制备a) 培养基配方b) 配置过程：计算称量溶解（调节PH-分装-包扎）灭菌2. 倒平板a) 用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上，待培养基冷却到50左右时开始倒平板。b) 在酒精灯火焰旁一只手拿着装有培养基的锥形瓶，另一只手拔出瓶塞，使瓶口迅速通过火焰23次，并转动瓶口，通过灼烧灭菌，防止瓶口微生物污染培养基。c) 再取无菌培养皿，在火焰旁用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于锥形瓶瓶口的缝隙，将锥形瓶中的培养基倒入培养皿中，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。注意不要将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，容易在皿盖与皿底之间培养基上滋生。d) 等平板冷却凝固后，将平板倒置备用，防止冷凝水回流。3. 稀释涂布平板法接种及计数a) 操作：将1土壤溶解于100mL的无菌水中制成土壤悬液，逐步10倍稀释，选取,三个浓度，每个浓度至少3个平板。b) 每克土壤样品的细菌数某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数稀释倍数(涂布所用稀释液为1)。c) 例子：稀释下，取菌液1涂平板后，三个平板的菌落平均数是250个，则每克土壤样品的细菌数=2.54. 显微镜直接计数法(1) 血球计数板：血球计数板其上有特定面积为1、高为0.1的计数室，一个计数室又被分成25个(或16个)中方格，每个中方格再被划分成16个(或25个)小方格，每个计数室都由400个小方格组成。图为2516的计数室(3) 操作过程 血球计数板盖上盖玻片无菌滴管吸取摇匀的微生物培养液，滴在盖玻片边缘，缓慢渗透进入计数室。 加样后静止5，然后在显微镜下计数45个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的菌体总数。 计算公式：1悬液所含菌体总数每小格平均菌体数400稀释倍数。 例子：55的中方格中有15个细菌，则悬液所含菌体总数400稀释倍数。5. 两种计数方法的比较(1) 稀释涂布平板法计数，能直接区分活细胞和死细胞，但是计数结果偏少。(2) 显微镜直接计数法，不能直接区分活细胞和死细胞，除非用染色剂，如台盼蓝。平板划线法1. 低温保存的纤维素分解菌的纯化单菌落的方式平板划线接种(1) 临时保藏：使用频繁，先接种到试管的固体斜面培养基上培养，然后4度保藏。(2)甘油管藏：长期保存的菌种，先把菌液转入到灭菌后的甘油中，混匀放在零下20度的冷冻箱保存。2.纤维素分解菌的单菌落的方式平板划线接种植物细胞工程进阶植物细胞工程1.植物组织培养的概念将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。2. 菊花的组织培养(1) 原理：植物细胞的全能性(2) 组织培养的过程3. 植株体细胞杂交(1) 原理：植物细胞膜的流动性和植物细胞全能性，变异类型属于染色体变异。(2) 过程(3) 意义：克服了不同生物远缘杂交不亲和的障碍。植物细胞工程的应用植物繁殖的新途径(1) 快速繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术叫作植物的快速繁殖技术，也叫微型繁殖技术，是一种无性繁殖。(2) 作物脱毒：如马铃薯、草莓等植物正常情况下易感染病毒，通过无性繁殖传给后代后致使产量下降，利用植物顶端分生区附近（如茎尖）这种无病毒的外植体进行组织培养，达到脱毒的目的。(3) 人工种子：组织培养到胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等为材料经过人工薄膜包装得到的种子。2. 作物新品种的培育(1) 单倍体育种 取材：花药（或花粉）。 过程：其中花药离体培养的过程属于组织培养。 意义：极大地缩短了育种年限，节约了大量的人力和物力。(2) 突变体的利用：在植物的组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断增殖的状态，因此它们容易受到培养条件和诱变因素（如射线、化学物质等）的影响而产生突变。其中产生的有用的突变性状通过有性生殖无法传递或者产生性状分离，利用组织培养可以维持突变体的优良性状。(3) 异源多倍体 技术：植物体细胞杂交。 如白菜甘蓝、普通小麦长穗偃麦草等。3. 细胞产物的工厂化生产(1) 次生代谢产物：植物会产生一些对人体十分有用的次生代谢产物，次生代谢产物不是生物生长所必需的，一般在特定的组织或器官中，并在一定的环境和时间条件下才进行。所以次生代谢物含量低、难提取。通过植物细胞培养可以大量的提取次生代谢产物。(2) 植物细胞培养 在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖。 一般培养到愈伤组织阶段，植物细胞培养用的是液体培养基。(3) 实例 紫草宁：从紫草细胞中提取的一种药物和色素，具有抗菌、消炎和抗肿瘤等活性。 紫杉醇：红豆杉属植物体内的一种次生代谢物，具有高抗癌活性。 人参皂苷：利用人参细胞培养的人参中重要的活性成分。动物细胞工程进阶干细胞概念介绍1. 干细胞分布：早期胚胎、骨髓和脐带血等。 干细胞分类：胚胎干细胞、成体干细胞等。2. 胚胎干细胞(1) 分布：早期胚胎。(2) 特点：具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。(1) 成体干细胞(1) 特点：具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。(2) 分类：造血干细胞、神经干细胞、精原干细胞等。(2) 诱导多能干细胞（简称iPS细胞）(3) 来源：通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞。 已分化的T细胞、B细胞也能被诱导为iPS细胞。(4) 诱导方式：借助载体将特定基因导入细胞；直接将特定蛋白导入细胞；用小分子化合物诱导。(5) 特点(a) 诱导过程无须破坏胚胎。(b) 可来源于病人自身体细胞，理论上可以避免免疫排斥反应。动物细胞培养干细胞动物细胞培养2. 植物组织培养和动物细胞培养的对比动物细胞融合技术与单克隆抗体“ADC作用机制”动物细胞融合技术(1) 原理：细胞膜的流动性。(2) 诱导方法：PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法等。(3) 结果：融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。(4) 意义：突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。2. 单克隆抗体及其应用(1) 血清抗体：从动物血清中分离，产量低、纯度低、特异性差。(2) 单克隆抗体：特异性强，灵敏度高，可大量制备。(3) 单克隆抗体的制备过程 第一次筛选：用特定的选择培养基，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 第二次筛选：抗体检测，获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。利用抗原抗体的特异性，采取96孔板，每个孔内一个细胞，注射抗原，若产生沉淀，则为特异性杂交瘤细胞。 杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生特异性抗体。3. 单克隆抗体的应用(1) 诊断试剂：单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。(2) 治疗疾病和运载药物。胚胎工程进阶胚胎工程的理论基础精子和卵子的发生2. 精子的结构和卵细胞结构3. 体内受精4. 胚胎早期发育胚胎工程技术及其应用体外受精(1) 卵母细胞的收集：减数第二次中期。(2) 精子：获能处理。(3) 受精：将获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促使它们完成受精。(4) 应用 提高动物繁殖能力。 为胚胎移植提供可用的胚胎。2. 早期胚胎培养(1) 培养液成分：无机盐、有机盐（两盐）；维生素、激素（两素）；氨基酸、核苷酸（两酸），水和血清等。(2) 培养阶段：一般培养到桑椹胚胚或者囊胚。3. 胚胎移植(1) 概念：将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育长为新个体的技术。(2) 供体的选择和处理 遗传性状优良、生产能力强。 超数排卵处理。(3) 受体的选择和处理 体质健康、繁殖能力正常。 与供体进行同期发情处理。4. 胚胎分割(1) 概念：采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。(2) 过程(3) 胚胎来源：桑椹胚胚或囊胚。囊胚要注意分割是要把内细胞团对称分割。(4) 滋养层：做DNA分析、性别鉴定。动物细胞核移植1. 动物细胞核移植(1) 概念 将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体。通过核移植培育得到的动物称为克隆动物。(2) 分类 胚胎细胞核移植、体细胞核移植。(3) 体细胞核移植的过程(a) 卵母细胞采集：卵巢。 卵母细胞时期：体外培养到期。(b) 重构胚：人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。(c) 诱导细胞融合：电融合法。 激活重构胚：物理或化学方法（电刺激、 Ca2+ 载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等）。(1) 体细胞核移植技术的应用(2) 畜牧生产。(3) 医药卫生领域。(4) 治疗人类疾病等。基因工程1基因工程的工具概述限制性内切核酸酶(1) 来源：主要从原核生物中分离纯化出来。(2) 化学本质：蛋白质。(3) 特异性：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列。(4) 作用位点：磷酸二酯键。(5) 作用结果：产生黏性末端或平