资料编号：资料三药品名称 注射用重组人甲状旁腺素（1-34）资料项目名称 立题目的与依据研究机构名称：上海富纯中南生物技术有限公司研究机构主要研究者姓名：杨子义试验人员姓名：高景燕、徐骥、张晴妮、沈磊试验起止日期：2004年10月2006年6月原始资料保存地点：上海富纯中南生物技术有限公司联系人姓名：杨子义联系电话：021-51320123 13818244750电子信箱：yangziyibiochinan.com申请人机构名称：上海富纯中南生物技术有限公司立题目的与依据1立题目的骨质疏松是常见病与多发病，由于该病的发病率高、并发症较为严重、缺乏理想的预防和治疗措施，日益成为人们关注的焦点，随着老龄人群的增加，发病率亦呈上升趋势。预测目前我国有骨质疏松患者8400万，占总人口的6.6。到2050年将增加达21200万，占总人口的13.2。我国数个大城市所做的调查表明, 大于50岁的人群中20.1%的人有骨质疏松现象。上海市的调查结果显示，男性发病率为13.4%，女性为40.1%，60岁以上老人中，男性为14.6%，女性为61.8%。南京市调查751人45岁以上妇女中患病者167例，占22.24。在老年人中，骨折的流行病学还显示城市老年女性发生率高达19.6%，其次是城市男性12.4%，农村女性8.8%，农村男性3.4%。上述流行病学资料充分表明：我国骨质疏松症的患者人群数量庞大。各种类型骨质疏松的发病原因是不同的，但是基本病理改变却是相同的，即由于骨质吸收超过骨质合成从而造成全身性的骨质丢失。骨骼正常形态的维持依赖于骨质合成和骨质吸收之间的动态平衡，过去治疗骨质疏松的主要手段，一是促进骨矿化的药物，如维生素D及各种种类的钙制剂等；二是抗骨吸收的药物，如目前常用雌激素类药物替代疗法、双膦酸盐、降钙素等，但由于这些药物防治效果不尽理想和伴随一些不良反应等原因而难以让广大患者接受。开发更有效、安全、价廉的骨质疏松防治药物，尤其是能够促骨形成的药物已成为当前主要的研究目标。近年来，甲状旁腺素（Parathyroid hormone, PTH）的抗骨质疏松作用已引起国内外研究者的关注。在体内甲状旁腺素由甲状旁腺上皮细胞合成、储存和分泌，是由84个氨基酸组成的多肽激素。甲状旁腺上皮细胞内转录的mRNA编码的前甲状旁腺素原（Pre-pro-PTH），由115个氨基酸组成，在成熟PTH肽段氨基端还有23个氨基酸残基的信号多肽和6个氨基酸残基的激素原序列。信号多肽序列和激素原序列分别在内质网和高尔基体中被酶切成为84个氨基酸的PTH储存在细胞内，在低血钙信号的刺激下其释放，成为调节机体血钙浓度的主要因子。进入血循环的PTH又迅速转变成氨基端和羧基端二个肽段，其中PTH 氨基端1-34氨基酸残基肽段为PTH完整生物活性基团，调节血钙浓度及骨代谢，免疫活性小，而羧基端的肽段为PTH免疫活性多肽，其生物学作用还不是十分清楚1。通过对结构与功能关系的研究表明，PTH（1-34）有三个结构肽段并形成螺旋区-连接区-螺旋区的二级结构。它们可以与体内多种细胞膜上的PTH受体R1和R2结合，其中与R1受体结合可以激活腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP水平升高，与R2结合主要是使磷脂酶C激活。PTH34的羧基端参于与受体的结合，其中25-34位氨基酸残基与受体形成主要结合位点，10-27位氨基酸残基形成次要结合位点，而PTH（1-34）氨基端1-10位氨基酸残基是激动受体产生生物活性的主要肽段。PTH对骨形成的影响，主要是通过作用于骨组织细胞和肾小管上皮细胞而产生的。对于肾小管上皮细胞，PTH主要增加远曲小管的钙的重吸收和通过增加肾脏产生有活性的维生素D间接促进肠道对钙的吸收，共同提高血钙浓度，有利于骨的形成。对于骨组织则既有促进骨吸收，又有促进骨形成作用。PTH主要是通过以下机制影响骨形成: (1)促进间充质前体细胞向成骨细胞的增生和分化；(2)抑制成骨细胞的凋亡，延长其成骨作用时间；(3)促进成骨细胞的自分泌作用产生细胞因子，增强成骨细胞的成骨作用；(4)对破骨细胞的间接作用。成骨细胞受PTH刺激后还可以分泌溶骨性细胞因子来活化破骨细胞，并通过适度的骨吸收为新的骨基质形成提供附着面，有利于成骨细胞进一步发挥作用。PTH小剂量间隙应用的作用主要为促进骨形成，并提高骨强度。当PTH大剂量使用时，一方面引起破骨细胞广泛的活化，另一方面成骨细胞内特异性转录因子和成骨蛋白表达水平普遍下降，成骨细胞的功能反而受到抑制2。骨质疏松症是以骨量减少、骨组织微结构退化为特征，以致骨脆性增高而骨折危险增加。其中治疗原发性骨质疏松症（主要是绝经后骨质疏松症和老年性骨质疏松症），维持骨质合成和骨质吸收之间的平衡主要在于促进骨形成，因为老年人发生骨折时骨量丢失通常已达30%，单纯的抗骨吸收作用以很难达到理想效果。当然，绝经后骨质疏松症患者因为雌激素减少而破骨细胞活性增强，使用抗骨吸收作用的药物如二瞵酸盐类药物，对预防骨折有一定作用。美国Eli Lilly公司研发的rhPTH（134）已于2002年11月上市销售（商品名FORTEO），其主要适应症为骨折患者治疗和预防二次骨折发生，临床疗效明显。2 国内外PTH的研发、生产与临床应用情况近年来，外源性甲状旁腺素（PTH）的抗骨质疏松作用已引起国内外研究者的广泛关注。研究证实，PTH既有促进骨吸收，又有促进骨形成的作用，小剂量间隙应用主要促进骨形成，并提高骨强度，从而降低骨折危险性3。美国Eli Lilly公司早在上世纪九十年代就研发重组人PTH（1-34），并命名为Teriparatide4。1997年Lindsay等5 进行了注射剂量为25g/d Teriparatide，正在接受激素替代疗法（hormone replacement therapy, HRT）的绝经妇女骨质疏松症患者的随机双盲试验，17个病人只接受激素替代疗法，另17个病人接受激素替代疗法和注射Teriparatide，结果表明3年内接受HRT+Teriparatide的患者脊椎骨密度（Bone mineral density，BMD）持续增加，而前一组则无明显差别。以后由Neer等3负责进行三期临床试验，17国家99个临床试验中心的1637位妇女进行双盲对照研究，所有参试者均患有骨质疏松且有椎骨骨折历史,治疗组每天皮下注射重组人PTH(1-34)20g和40g,共19个月,结果:再骨折发生率对照组14%、20g组5%、40g组4%、治疗组骨折相对危险分别为0.35(95%CI, 0.220.55)和0.31 (95%CI, 0.190.50)，与对照组比较,脊柱BMD分别多增加9%和13%，股骨颈BMD分别多增加2%和6%，40g组桡骨干BMD比对照组多增加2%，BMD增加与药物剂量成正比相关，但两种剂量降低骨折危险性相似。Cosman等6对54名已接受激素替代治疗(HRT)治疗2年以上的绝经后妇女进行临床对照研究，27例患者同时接受PTH(1-34)(20g/d或40g/d)，3年后，单用HRT患者骨折发生率37.5%，HRT+PTH组8.3%；HRT+PTH组骨形成和骨吸收的生化指标在6个月时达到峰值，维持了30个月，BMD增加13.4%(脊柱)、4.4(全髋)、3.7%(全身),停止注射后，疗效维持1年。但本研究未提示骨折发生率下降。有多个国家参加的双盲对照临床研究，观察了247例绝经期伴腰椎或股骨近端骨量减少或骨质疏松的妇女,按近期用HRT超过1年和未用HRT超过1年分为两组，再随机分到rhPTH(1-34)40g组和对照组,所有患者均继续接受HRT，用双能X线骨密度仪(DEXA)测定治疗前和治疗15个月后BMD和骨含量。结果：与单纯HRT比较，rhPTH(1-34)+HRT组腰椎和股骨近端BMD和骨质量显著增加,无论是否正在接受HRT。 临床研究中还发现,停用PTH后，疗效可以维持一定时间。一项有1642名曾有一次或多次椎骨骨折的妇女自愿参加的临床对照研究发现，使用19个月PTH(1-34)，非创伤性脊柱骨折和非脊柱骨折的发生率，分别下降65%69%和53%54%，腰椎BMD增加9.7%13.7%。进一步对其中的1261例患者停药6个月观察，非创伤性脊柱骨折和非脊柱骨折的发生率仍低于对照组7-9。研究中，rhPTH（1-34）可以被很好的耐受，没有发现一例患者发生甲状旁腺素大剂量长时间给大鼠用药出现的骨肿瘤发病率增加。在大鼠进行的rhPTH(1-34)大剂量（5、30、75g /kg/day）和长时间（二年）并从幼鼠生长期就开始给药的研究中发现，过度骨组织生长和成骨细胞瘤的发生率，与对照组比较没有显著差异。但骨肉瘤的发生率却明显增加，并且与持续用药时间和给药剂量呈显著的相关性。这种给药的剂量与给药强度在人体难于实现，而且上千例的临床试验者中和已经使用该药的患者中均未发现相似的情况，药物说明书中只是提醒使用者有此危险性的可能。使用此药目前还是安全有效的10。美国礼莱公司已完成了Teriparatide 的临床研究，并于2002年11月获FDA批准上市销售，商品名为“FORTEOTM”，其28天注射量每日注射20g的笔式注射剂型包装市场价格为530美元，约合每天19美元治疗费用。美国NPS制药公司(Nasdaq:NPSP)也在开发重组人甲状旁腺素，并于2002年初进行rhPTH(1-84)III期临床试验，药物代号位ALX111，在欧洲进行多中心研究，试验周期为24个月，该药现已上市销售（商品名字PREOSTM）。国内有一些研发单位和企业正在开发重组人甲状旁腺素，目前部分处于临床前研究或临床研究，其中大部分已经进入临床试验阶段。3 创新性与可行性分析我公司立项开发rhPTH(1-34)，利用公司多年在重组DNA药物研发上积累的经验和符合GMP标准的实验室条件，在不到2年的时间内完成了rhPTH(1-34)临床前研究。利用pET-32a分泌表达系统，经密码子优化的人工合成的人PTH（1-34）基因序列，构建PTH34-pET-32a表达载体，转化大肠杆菌E. Coli BL21(DE3)获得高效融合蛋白的分泌表达，融合蛋白的表达水平达到30左右，经亲和层析，肠激酶（enterokinase, EK）酶切及离子交换层析，得到纯度95，比活性达10000IU/mg rhPTH(1-34)。此工艺简单稳定，每升发酵液可得rhPTH(1-34)约100mg。每支成品（20g/支）的直接成本低于3元，因此具有明显经济效益。我公司研制的rhPTH(1-34)经中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理研究室应用卵巢摘除（OVX）的去势大鼠建立原发性骨质疏松症模型，治疗6周后，中剂量（10g/kg）组即对二个模型骨质疏松大鼠的股骨、腰椎骨量、生物力学性能和腰椎骨小梁面积显示明显提高作用，并随治疗剂量增加而提高。经中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理研究室中心利用大鼠及食蟹猴毒理安全性评价，均未发现有明显毒性作用。经中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所药物代谢研究中心所做的与美国礼莱公司FORTEOTM作为对照药品生物等效性研究证明，二者有相同的药物代谢曲线。综上分析，rhPTH(1-34)的研发是可行的。rhPTH(1-34)研发成功必将给中国的骨质疏松症患者带来福音。4 参考文献1. 上海医科大学实用内科学编委会 陈灏珠主编 实用内科学 第10版 人民卫生出版社2. Kurland ES, Cosman F, McMahon DJ, et al. Parathyroid hormone as a therapy for