生命科学学院2012届本科毕业论文河南大学本科毕业论文 蜡样芽孢杆菌突变体关于分泌淀粉酶的研究毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。作 者 签 名： 日 期： 指导教师签名： 日期： 使用授权说明本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。作者签名： 日 期： 蜡样芽孢杆菌突变体关于分泌淀粉酶的研究摘 要：实验通过卢戈氏碘液染色法和观察透明圈的方法，以蜡样芽孢杆菌0-9菌株为对照，对0-9菌株通过转座形成的突变体产生胞外淀粉酶能力的差异进行研究。实验结果发现，在固体淀粉培养基、30、24h培养的条件下，突变体36、38号菌产生淀粉酶的能力远大于对照组，突变体56、94号菌产生淀粉酶的能力远小于对照组。这些突变体可进一步为探索菌体胞外淀粉酶的分泌能力和菌体在小麦中的定植能力之间的关系做好准备，对小麦病虫害的防治也具有一定的意义。 关键词：卢戈氏碘液染色法 转座 蜡样芽胞杆菌0-91 前言1.1生物防治1.1.1生物防治的概念生物防治包括以虫治虫和以菌治虫。其主要措施是保护和利用自然界害虫的天敌、繁殖优势天敌、发展性激素防治虫害等。是人类依靠科技进步同病虫草害做斗争的重要措施之一。以菌治虫是80年代新兴的生物防治技术。它是利用昆虫的病原微生物杀死害虫。这类微生物包括细菌、真菌、病毒、原生物等，对人畜均无影响，使用的时候比较安全，无残留毒性，害虫对细菌也无法产生抗药性，因此，微生物农药的杀虫效果在所有防治技术中名列前茅。1.1.2 生物防治的意义长期以来，主要通过化学农药来防治植物病害，虽然这种方法能够较快地防治疾病，但是也引起了植物病原抗药性、农药残留等问题，造成了严重的环境污染和生态破坏。植物内生细菌几乎存在于所有健康植物体内，与植物和谐共处，不仅能够避免使用化学农药给人类健康和环境带来的隐患，还能避免使用杀菌剂在杀死病原菌的同时杀死在环境中起重要作用的非靶微生物和使用其他生物菌肥破坏植物根际土壤的微生态平衡，因此有效生防菌的筛选在植物病害防治上有很大的应用潜力。当前制约生防菌利用的关键因素是抑菌活性不够强，生防菌在自然环境中定殖能力差，形不成优势生态菌群来阻止病原菌的侵染。1.2 腊状芽孢在生物防治中的作用蜡样芽孢杆菌0-9是由本实验室分离保存的小麦内生细菌，该细菌对小麦纹枯病有很强的生物防治作用。1.2.1 增强宿主竞争优势的作用竞争作用是内生芽孢杆菌在寄主体内发挥作用的重要机制之一，主要通过内生菌与病原菌相互竞争位点来夺取营养物质，从而抑制植物病害的发生。竞争作用与施用剂量、时间、定殖能力及种群建立状况密切相关。研究表明，芽孢杆菌进入植物体内的途径和方式与病原菌基本相似1，进入寄主体内以后，芽孢杆菌会优先占据病原菌的入侵点，与病原菌争夺营养，可有效降低该病原菌及其毒素的积累。1.2.2 增强宿主接抗性的作用拮抗作用是指内生菌通过同化作用产生抗菌物质抑制病原菌生长或直接杀死病原菌。芽孢杆菌能够分泌多种抗真菌和细菌作用的拮抗物质，它们对病原菌具有直接的抑制作用。刘建国等2研究发现B. cereus S1 能产生新型抗真菌环状多肽APS，抑菌实验表明，此多肽有广泛的抗菌谱且抑菌持久，对病原真菌的孢子萌发和菌丝的生长均具有显著的抑制作用。关于抑菌机制各国学者有不同的看法，有待深入研究。1.2.3 促进宿主植物生长的作用感染很多内生菌进入植物体内后，寄主植物都会表现出明显的生长作用。研究发现，内生芽孢杆菌能产生或诱导植物产生生长素 (IAA)、赤霉素 (GA3)、玉米素 (ZR4) 等，这些生长激素能促进植物生长。唐文华等 (1992) 曾对7 株蜡样芽孢杆菌增产菌的发酵液进行了植物生长激素类物质的高压液相色谱分析，结果发现吲哚乙酸、玉米素和赤霉素在所有菌株中普遍存在，吲哚乙酸的含量较高且稳定，说明增产菌所产生的植物激素是其促进植物生长发育的重要原因之一3。此外，一些菌株能合成嗜铁素、有机酸等物质，促进寄主植物对氮、磷等营养元素的吸收。王东明等4筛选的蜡样芽孢杆菌6371 能转化有机氮磷，分泌有机酸，降解土壤中难溶性无机盐，分泌抗菌物质，抑制病源菌的生长，增强植物抗逆境胁迫的能力。1.2.4 帮助宿主诱导植物抗性的作用芽孢杆菌能够诱导寄主植物产生一些物理结构上的抗性（例如形成生物膜等形式），从而限制病原菌进一步侵入。Benhamou等5用内生菌B. pumilus SE34 预接种基因转化豌豆，然后接种病菌。在病菌企图侵入部位大量沉积木质和酚类物质，使这些部位的细胞胞壁得到加厚，有效阻止了病菌的侵入。此外，芽孢杆菌还能诱导寄主植物生理生化发生变化，积累相关蛋白，合成一些代谢产物，产生水解酶和氧化酶等(如几丁质酶、-1,3 葡聚糖酶、过氧化物酶)，从而抑制病原菌生长。蜡样芽孢杆菌便能分泌超氧化物歧化酶 (SOD)，使植物产生对病原菌的抗病性。尽管国内外学者就内生芽孢杆菌对植物的上述四种作用方式形成共识，然而相关的作用机制研究仍处于探索阶段。关于内生菌对病原菌的抑制作用、增强宿主植物抗逆性作用机制的研究报导较少，多为推论性或者是间接性的6；对于内生菌在植物体内定植规律的研究尚处于探索阶段，随着分子生物学技术的发展，荧光标记技术、电镜免疫胶体金技术、酶联免疫反应技术和基因标记等技术被应用于内生菌的定殖规律研究7-10，但由于宿主植物生活环境多样性以及内生菌与宿主植物关系的复杂性，加之植物内生菌起源演化的问题尚无定论，目前对于内生细菌进入植物的途径、在植株体内的定殖传导方式、内生细菌与寄主植物的互作用、生物学功能作用机制等不是很清楚11。只有对生防菌的抗菌机制、诱导抗性促生机理等深入研究，进一步完善基础理论，才能更好地开发和利用生防菌资源。1.3 产胞外淀粉酶的菌株对生防的作用1.3.1 胞外淀粉酶的检测方法 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称。淀粉酶能将可溶性淀粉、直链淀粉或者糖原分解为麦芽糖、糊精、葡萄糖等物质。淀粉与卢戈氏碘液产生反应生成蓝色物质，而被淀粉酶水解过生成的物质不会出现蓝色反应。由此可以在培养基中加入淀粉，然后用碘液染色，变蓝的地方说明有淀粉存在，没有变蓝的会出现一个透明的圈，这个范围内的淀粉被淀粉酶水解。故可以利用透明圈的大小来判断菌体产生淀粉酶的能力差异。 1.3.2 产胞外淀粉酶的腊状芽孢杆菌在小麦体内的定植 小麦贮存物质主要以淀粉的形式存在于胚乳中，在小麦发芽时，胚乳中的淀粉会被动用，用于为萌发提供必要的营养、能量等。在萌发期间小麦会产生大量的淀粉酶将其储存的淀粉水解，以供萌发使用。腊状芽孢杆菌为小麦根部的有益菌群，能够有效抵御外界生物的侵害。但是这种芽孢杆菌由于营养和空间的限制不能很好的定植于小麦根部，故起到的防护作用不是很大。现在如果能够筛选出一种菌能够产生的胞外淀粉酶较多，能很好的利用小麦体内的营养，较为牢固的定植于小麦体内，那能够较为有效的抑制小麦的病虫害，为小麦的增产有很大的作用。 1.4 0-9菌株 蜡样芽孢杆菌，革兰阳性杆菌，大小为0.9-1.2m1.8-4.0m，两端钝园，一般从短链到长链，培养6h后即可形成芽胞，芽胞位于菌体中央，椭圆形，不膨出。周生鞭毛。能运动。无荚膜。生长时需氧或兼性厌氧，在普通琼脂培养基中生长旺盛，形成较大、灰白色、表面粗糙似融蜡状菌落，因此而得名；在复杂培养基中能呈厌氧生长，葡萄糖和硝酸盐可促进厌氧生长；生长温度范围为5-30，10以下停止繁殖。其繁殖体不耐热，100经20min可被杀死。最适生长温度为28-35，生长酸碱度范围为pH4.3-9.0，生长最低水分活度为0.95。发酵葡萄糖，产酸并产气。 蜡样芽孢杆菌0-9菌株是1株从健康小麦植株中分离获得的有益芽孢杆菌，为小麦内生细菌，属革兰氏阳性蜡样芽胞杆菌，运动性强，具有产生葡聚糖酶、几丁质酶和蛋白酶等真菌细胞壁降解酶和铁载体的能力。该细菌对小麦纹枯病病原菌有抑制作用，抑菌率50%70%，实验室条件下防治效果高达82.86 %。 利用生防菌株0-9抗利福平（Rifampicin，Rif）标记法，得到300株抗Rif菌株。随机选取其中9株，通过形态学观察、革兰氏染色、芽孢染色、产酶能力、运动性、拮抗作用及耐盐性测试等实验，证实这些抗药标记菌株为0-9的衍生菌株，并保持对小麦纹枯病的防治效果。1.5 研究背景及意义芽孢杆菌对马铃薯疮痂病、苹果红癌病、赤霉病等许多土传病害以及地上部病害具有生防的效果。用于生防的芽孢杆菌种类有枯草芽孢杆菌(B.subtilies) 、多粘芽孢杆菌( B. polymyxa) 、蜡状芽孢杆菌( B.acillus cereus) 、蕈状菌变种( B.cereus varm ycoides)等。随着枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性代表菌株基因组被测序以来，同枯草芽孢杆菌有关的研究，特别是有关生化分析、分子生物学等方面基础理论研究持续展开。当今人们的环保意识在不断的增强，生物农药正在引起越来越多的关注。芽孢杆菌杀菌剂克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点，在微生物杀菌剂市场中初露头角。很多优良的枯草芽孢杆菌菌株已经应用于生产实践。在生防应用中，让菌体能很好定植是一个很重要的问题。但是菌体由于营养的限制总是不能再植物体内形成优势菌株，不能对植物形成有效的保护伞。那么我们的迫切要求改良菌种的遗传物质，使其能够很好的利用植物体内的营养物质生存。碳源是限制菌种生存的主要原因，如能够将0-9菌株遗传物质改良为能够很好利用小麦淀粉的菌，那么会对小麦生物防治病虫害有良好的效果。2 材料与方法2.1 供试材料2.2.1 供试菌株菌种0-9。由河南大学实验室从健康小麦体内分离得到，0-9为蜡样芽孢杆菌。菌株保存于-70 超低温冰箱。2.1.2 培养基LB培养基：蛋白胨 10.0g，酵母提取物 5g，NaCl10.0 g，蒸馏水1000mL，PH7.0。一部分加入2%（w/w）琼脂用来制备固体LB培养基，另一部分制备液体LB培养基。灭菌条件：121 、0.11Mpa灭菌20min。淀粉培养基：可溶性淀粉 5.0g,加热至淀粉溶解，蛋白胨 10.0g,牛肉膏 3.0g,定容至1000 mL，PH7.0，加入2%（w/w）琼脂制备固体淀粉培养基。灭菌条件：121 、0.11Mpa灭菌20min。2.1.3 所用试剂 （1） 卢戈氏碘液 碘化钾 0.4g 碘片0.2g 蒸馏水 60mL