活性污泥生物相镜检1 范围本标准规定了活性污泥镜检的方法原理、仪器与试剂、操作步骤、及术语。本标准适用于地表水、生活污水、工业污水处理活性污泥的生物相检测。2 方法原理利用显微镜的放大原理观察视野中的各种生物，根据观察到的生物形态、运动方式、生物（细胞）结构初步判断所观察到的生物的种类。3 试剂与仪器3.1 显微镜3.2 载玻片3.3 盖玻片3.4 石炭酸复红染色液3.5 香柏油3.6 二甲苯4 操作步骤 4.1 水浸片标本制备：取污泥样液1小滴滴于载玻片上（若污泥浓度太大用水稀释）小心地盖上盖玻片，以免产生气泡。4.2 染色标本的制备：取污泥样液1小滴滴于载玻片上、涂片、固定、用石炭酸复红染色、水洗、干燥、待检。4.3 显微观察4.3.1 将水浸片标本低倍显微镜观察生物相全貌，注意观察污泥颗粒的大小，污泥结构的松紧程度，菌胶团和丝状菌的比例及其生长情况，加以记录并做必要描述。4.3.2 高倍镜下进一步观察原生动物外形和运动情况，观察菌胶团的胶质厚薄和色泽等状况。4.3.3 将染色标本在油镜下观察比较各污泥样品中微生物种类、数量、菌胶团形状的异同。4.3.4 将观察到的原生动物用笔将其形态描绘在纸上，并统计各种原生动物的数量。4.3.5 在高倍镜下找到标本的物相，连接数码相机将其形状拍摄下来，由专业人员观察。4.3.6 将显微镜各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。5 术语5.1 活性污泥生物相：是指活性污泥中微生物的种类、数量、优势度及其代谢活力等状况的概貌。生物相能在一定程度上反映出曝气系统的处理质量及运行状况。5.2 微型动物类纤毛虫：如钟虫、盖纤虫、累枝虫等，还可见到部分J纤虫在絮粒上爬动，偶尔还可以看到少量的游动纤毛虫等，在出水水质良好时，轮虫生长活跃。6 几种生物相对活性污泥状况的指标6.1 钟虫不活跃或呆滞，往往表明曝气池供氧不足。如果出现钟虫等原生动物死亡，则说明曝气池内有有毒物进入，如有毒工业废水流人等。6.2 当发现没有钟虫，却有大量的游动纤毛虫如各种数量较多的草履虫、漫游虫、豆形虫、波豆虫等，而细菌则以游离细菌为主，此时表明水中有机物还很多，处理效果很低。5b|!P2( q3W:z0如果原来水质良好，突然出现固定纤毛虫减少，游动纤毛虫增加的现象，预示水质要变差。相反，原来水质极差，逐渐出现游动纤毛虫为主，则水质变得良好。通常，固定纤毛虫大于游动纤毛虫+轮虫，出水BOD5约在510mgL；固定纤毛虫等于游动纤毛虫，出水BOD5约在1020mgL。环保圈-环保人的圈子L6U|QjKh镜检中如发现积硫较多的硫丝细菌、游动细菌(球菌、杆菌、螺旋菌和较多的变形虫、豆形虫)时，往往是曝气时间不足，空气量不够，流量过大，或水温较低，处理效果差。6.3 在大量钟虫存在的情况下，植纤虫数量多而且越来越活跃，这对曝气池工作并不有利。要注意，可能污泥会变得松散，如果钟虫量递减，植纤虫递增，则潜伏着污泥膨胀的可能。6.4 镜检中各类原生动物极少，球衣细菌或丝硫细菌很多时，污泥已发生膨胀。6.5 当发现等枝虫成对出现、并不活跃，肉眼能见污泥中有小白点，同时发现贝氏硫菌和丝硫细菌积硫点十分明显，则表明曝气池溶解氧很低，一般仅05mgL左右。6.6 如果发现单个钟虫活跃，其体内的食物泡都能清晰的观察到时，说明污水处理程度高，溶解氧充足。6.7 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。附录A光学显微镜的使用及生物相的观察1、显微镜的基本结构及油镜的工作原理 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因： 1.1 增加照明亮度 油镜的放大倍数可达 100 ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（ n=1.55 ）相仿的油镜（通常用香柏油，其折射率 n=1.52）。 1.2 增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，分辨力D可表示为：D=/2N.A，式中= 光波波长； NA= 物镜的数值孔径值。 光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4-0.7 m ），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：NA=n sin 式中为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到 120O ，而 n 为介质折射率。由于香柏油的折射率（ 1.52 ）比空气及水的折射率（分别为 1.0 和 1.33 ）要高，因此以香柏油作为镜头于玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA 一般在1.2-1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（ NA 都低于 1.0）。若以可见光的平均波长 0.55 m来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4m的物体，而油镜的分辨率却可达到 0.2 m 左右。2、操作步骤 2.1 观察前的准备 2.1.1 显微镜的安置：置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约3-4cm 。镜检时姿势要端正。 取放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。2.1.2 光源调节：安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。 2.1.3根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。 2.1.4聚光器数值孔径值的调节：调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转换一次物镜都应进行这种调节。 在聚光器的数值孔径值确定后，若需改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过虹彩光圈的调节。当然，有关虹彩光圈、聚光器高度及照明光源强度的使用原则也不是固定不变的，只要能获得良好的观察效果，有时也可根据不同的具体情况灵活运用，不一定拘泥不变。 2.2 显微观察 在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。 2.2.1 低倍镜观察 将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降 10 物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节图象清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。 在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜*近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。 2.2.2高倍镜观察 低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。 在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦 (parfocal) 。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 2.2.3 油镜观察 高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过 1.0 ，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。 2.3 显微镜用毕后的处理 2.3.1 上升镜筒，取下载玻片。 2.3.2用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。 2.3.3用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。1