实验一 辣根过氧化物酶的活力测定及 过氧化物酶的动力学参数测定一、目的1. 掌握辣根过氧化物酶的活力测定方法；2. 学会酶的动力学参数的测定方法；掌握Hanes作图法。3. 学会可调微量进样器的结构及使用；4. 了解分光光度计仪器的使用。二、原理过氧化物酶催化以下反应： 2H2O2O2+2H2O 这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质类(hemeproteins)。过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。 辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，简称HRP，EC1111)是植物中研究得最深入的一种过氧化物酶，早在20世纪30年代就有人着手从辣根中分离此酶，以后又制备出结晶。 随着酶标技术的发展，作为标记酶，辣根过氧化物酶是目前使用最普遍的一种酶，它的标记物既能用于定位检测，也能用于定量测定。因此研究辣根过氧化物酶的动力学性质很有实际意义。 是一种含亚铁血红素的蛋白质，Mr在40 000左右，等电点7.2 溶于水，溶解度为5(WW)，溶液呈棕红色，透明。HRP可溶于.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而0.62饱和度以上则不溶。本实验以愈创木酚（邻甲氧基苯酚）和H2O2为底物，过氧化物酶H2O2放出新生态氧使无色的愈创木酚氧化成红棕色的四邻甲氧基连酚，反应式如下：过氧化物酶活力的大小在一定范围内与产物颜色的深浅呈线性关系，该产物在470nm处有最大的光吸收，故可通过测定A470的变化以测定过氧化物酶的活力。一般以引起1min内0.001吸广度值的变化量为一个酶活力单位U。酶促反应速率与各种因素有关，如底物浓度、酶浓度、温度等。酶的底物与酶促反应速率的一般符合Michaelis-Menten方程，即式中： r反应速率（mol/Lmin-1） rmax最大反应速率（mol/Lmin-1）S底物浓度（mol/L）Km米氏常数（mol/L） 将Michaelis-Menten方程的形式加以变换，可以得到多种方程。采用Hanes作图法：图1 测定Km的图解法以对S作图得一直线，其横轴截距为Km，斜率为。三、试剂与仪器1. 试剂：酶制剂：辣根过氧化物酶，配制适当浓度。0.02 mol/L愈创木酚溶液：取0.22ml 愈创木酚加水至100 ml。0.04 mol/L H2O2溶液：取0.4ml 30% H2O2 加水至100 ml，临用前配制。pH6.5 0.05mol/L的磷酸缓冲溶液2. 仪器：722、722S分光光度仪 电子天平 恒温水浴锅 秒表 微量可调进样器 离心管等四、步骤 1. 辣根过氧化物酶活力的测定：在室温下，取两个比色皿（带盖、光程1cm），按表加入反应物。表1 酶反应体系反 应 物对 照样 品缓 冲 溶 液愈创木酚溶液酶 液2.91 ml0.05 ml0 ml2.90 ml0.05 ml0.0 1ml 加好反应物，摇匀，在470nm读出A470值，为t=0时的读数。立即加0.01 ml 0.04 mol/LH2O2于两个比色皿中，立即摇匀记时，每隔15S/30S读数一次，2-5min。将所测样品的A470值减去相应时间的对照的A470值为实际的样品的A470值。2. 过氧化物酶的动力学参数测定将0.1mol/L的H2O2，用蒸馏水稀释成6种不同的浓度，按下表操作： 表2 Km测定操作过程表组别123456对照1-11-2对照2-12-2对照3-13-2对照4-14-2对照5-15-2对照6-16-2缓冲溶液(pH6.5)ml2.912.902.912.902.912.902.912.902.912.902.912.90愈创木酚溶液0.05ml酶 液ml0.010.010.010.010.010.01底物H2O2浓度0.010.020.040.060.080.10体积0.04 ml反应2-5min记录每隔5S/10S依次将pH6.5缓冲溶液、愈创木酚加入比色皿中，（对照中不加酶液）检测样中加入0.01ml酶液，摇均；再分别加入不同浓度的H2O2 0.04ml，立即摇均，记时，每隔5S/10S读数。用对照样作空白，进行调零。五、记录及数据处理1. 记录用秒表记时，每隔5S/10S读数。05101520253035404550550.01mol/L底物第1组0.030 0.043 0.056 0.070 0.082 0.094 0.105 0.116 0.126 0.134 0.142 0.150 第2组0.032 0.048 0.061 0.074 0.088 0.100 0.112 0.124 0.134 0.144 0.153 0.161 第3组0.039 0.055 0.070 0.084 0.095 0.109 0.122 0.133 0.143 0.152 0.162 0.169 0.02mol/L底物第1组0.040 0.057 0.073 0.090 0.107 0.124 0.141 0.157 0.173 0.190 0.206 0.221 第2组0.033 0.049 0.067 0.088 0.105 0.122 0.138 0.156 0.174 0.191 0.207 0.222 第3组0.003 0.005 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 0.017 0.019 0.021 0.023 0.025 0.04mol/L底物第1组0.064 0.086 0.108 0.128 0.149 0.171 0.193 0.215 0.237 0.258 0.280 0.301 第2组0.055 0.079 0.103 0.125 0.149 0.174 0.198 0.220 0.245 0.267 0.291 0.314 第3组0.047 0.068 0.091 0.111 0.132 0.154 0.176 0.198 0.219 0.242 0.265 0.286 0.06mol/L底物第1组0.047 0.071 0.097 0.123 0.149 0.174 0.199 0.225 0.252 0.277 0.309 0.329 第2组0.035 0.058 0.083 0.107 0.132 0.157 0.182 0.206 0.231 0.296 0.282 0.304 第3组0.031 0.056 0.079 0.103 0.127 0.152 0.178 0.199 0.225 0.251 0.275 0.299 0.08mol/L底物第1组0.036 0.062 0.091 0.117 0.141 0.170 0.197 0.223 0.252 0.278 0.306 0.334 第2组0.041 0.072 0.104 0.138 0.169 0.201 0.233 0.266 0.298 0.329 0.361 0.393 第3组0.005 0.028 0.049 0.064 0.094 0.115 0.138 0.158 0.181 0.207 0.228 0.253 0.10mol/L底物第1组0.020 0.049 0.079 0.113 0.141 0.171 0.202 0.230 0.261 0.292 0.326 0.354 第2组0.032 0.063 0.096 0.128 0.167 0.197 0.229 0.263 0.295 0.328 0.362 0.394 第3组0.035 0.058 0.086 0.112 0.142 0.167 0.197 0.224 0.256 0.281 0.301 0.336 2. 数据处理速率的求得采用excell作图，以时间为横坐标，OD值为纵坐标。该图斜率的即为斜率酶的反应速率。反应速率r=(0.0022+0.0024+0.0024)/3=0.0023此浓度下的第3组数据与同浓度下另两组相差较大，可能存在错误，故在求平均速率是舍去反应速率r=(0.0033+0.0035)/2=0.0034反应速率r=(0.0043+0.0047+0.0043)/3=0.0044反应速率r=(0.0052+0.0051+0.0049)/3=0.0051反应速率r=(0.0054+0.0064+0.0045)/3=0.0054反应速率r=(0.0061+0.0066+0.0055)/3=0.0061作Hanes图采用excell作图，以底物浓度S为横坐标， 值为纵坐标。S0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 r0.0023 0.0034 0.0044 0.0051 0.0054 0.0061 S/r4.348 5.882 9.091 11.765 14.815 16.393 求出Km、rmax上图的其横轴截距为Km，斜率为；则通过计算求出该酶的动力学参数。由图可知，横轴截距3.2766/137.53=0.023824,纵轴截距3.2766。所以Km=0.023824,Km/rmax=3.2766rmax=0.007274