从土壤里分离及鉴定细菌的实验方案1 实验材料：新鲜土壤。a） 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；高氏一号培养基 ；马铃薯蔗糖培养基； 细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培 养基； LB 培养基b） 试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等c）仪器：有玻璃珠100ml三角瓶（1）、培养皿（50套）、试管（20支）、移液 管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U 型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无 菌操作台、灭菌锅、纱布，电子天平、记号笔，火材等相关培养基的配方:相关培养基的配方表牛肉膏蛋 白胨琼脂 咖氓甘 培养基牛肉膏3g蛋白胨10g琼脂1520g水1000mlNaCl 5gPH 7. 47. 6高氏一号咖氓甘 培养基可溶性淀粉20g琼脂1520g水1000mlNaCI 0. 5gKNO3 1g .K2HPO43H2O 0. 5g MgSO4 7H2O 0. 5g FeSO47H2O 0. 01g马铃薯蔗 糖培养基葡萄 糖20g马铃薯200g琼脂1520g水1000ml细菌半固 体培养基肉膏蛋白胨液体咖氓甘 培养基琼脂0.35-0.4PH 7.6淀粉培养 基牛肉 膏5g蛋白胨10g琼脂1520g水1000mlNaCl 5g可溶性 淀粉2g葡萄糖酵 解培养基蛋白胨水培养基1000ml1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1-2mlPH 7.6乳糖酵解丄占辛甘 培养基牛肉 膏3g蛋白胨10g1.6%溴甲酚 紫乙醇溶液l-2ml水 1000mlNaCI 5g乳糖5gLB培养基酵母膏5g蛋白胨10g水 1000mlNaCI 10gPH 7.011实验总流程LB培养基1 土壤取样:2制备土壤稀释液：2.1. 称取土壤lg,放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡20min,即为稀释10-2的土壤悬液。2.2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔分别编上10-3、10-4、10-5、10-6。取已稀 释成10-2的土壤液，振荡后静止0.5min,用无菌吸管吸取1mL 土壤悬液加入10-3的无菌 水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-3土壤稀释液。同法依次 连续稀释至 10-4、 10-5 、 10-6,10-7 土壤稀释液。在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管（或枪头）3倒平板富集培养3.1 按照配方分别在三种培养基上富集培养，每一个稀释梯度每一个培养做三个平行实验。 其如下表：10-410-510-610-710-8牛肉膏蛋白 胨琼脂培养 基ABC高氏一号培辛甘 养基ABC马铃薯蔗糖培养基ABC3.2 吸取稀释液取一吸管，以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、10-6,10-7 土壤稀释液0.1mL,加在已 制好的平板培养基上。3.3 涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。3.4 计算出每克土壤中细菌的数量。细菌数=某一培养皿内真菌的菌落数X该培养皿接种液的稀释倍数即得4 分离4.1 配置 LB 培养基4.2 划线4.2.1 连续划线法将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于28300C温室培养。4.2.2分区划线法 用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线34条， 再转动培养皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二 次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。10-410-510-610-710-8连续划线法ABC分区划线法ABC4.4 斜面培养将分离好的菌接种到斜面培养基上培养保存5 鉴定5.1 细菌菌的基本形态及运动性鉴定a）简单染色步骤i. 涂片 取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾 有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注 意取菌不要太多）ii. 干燥与固定 涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰 2-3 次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微 微发烫为标准；iii. 染色 将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色 1.5miniv. 水洗倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大， 至洗出水无色为止；V.干燥用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；vi.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找 出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的 形态。b）革兰氏染色步骤i. 涂片先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域，在另一侧四个区域的位置 分别滴加半滴无菌水。分别取四种活跃生长期菌种（大肠杆菌，金黄色葡 萄球菌，枯草杆菌和一种自选菌）按常规方法涂片（不宜过厚），用酒精 灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定。ii. 初染滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位，染色1.5min后水洗；iii. 媒染先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖lmin后水洗；iv. 脱色先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s,立即用 水冲洗；v. 复染先用番红洗去水迹，然后滴加番红复染1.5min后水洗；vi. 镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找 出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。 分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断枯草杆菌以 及另一种自选菌的染色结果。c）半固体穿刺法观察细菌运动性i. 配制培养基配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基,分装于4支试管内，110度灭菌20-30 分钟，正立于烧杯中冷却至室温；ii. 在无菌操作台上右手握接种针，以针挑取菌苔垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近（但勿触及）试管底，然后循原路退出。如图所示：接种完成后在30C条件下培养两天观察并判断其运动性。5.2细菌菌的生理生化试验a) 淀粉水解试验i. 培养基制备配制淀粉培养基，灭菌后将冷却至50C左右，无菌操作制成平板；ii. 接种 用记号笔将平板划成四部分，将所鉴定的菌种在不同位置点种。(注：由于 四种菌对淀粉的水解程度不同，为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解 部位发生重叠，宜采用点种的方式，如下图)。接种完成后贴好标签；iii. 培养将上述已接种的平板倒置于30C培养箱中培养48小时。b) 葡萄糖发酵试验i. 培养基配制 将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德 汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。ii. 接种 用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。取盛有葡萄 糖发酵培养基的试管 2 支，接种鉴定菌，另一支作为对照。iii. 培养将上述已接种的试管置于30C培养箱中培养48小时。c) 乳糖发酵试验i. 培养基配制 将配制好的乳糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉 氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。ii. 接种 用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。取盛有乳糖 发酵培养基的试管2支，接种鉴定菌，另一支作为对照。iii. 培养将上述已接种的试管置于30C培养箱中培养48小时。d) 甲基红试验i. 培养基的配制 将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷 却至室温。ii. 接种 用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。取盛有蛋白胨水培养基的试管 2 支，接种鉴定的菌种。iii. 培养将上述已接种的试管置于30C培养箱中培养48小时。任务分配情况组成员任务第一组A组土样采集B组土样稀释第二组A组牛肉膏蛋白胨琼脂培养基下的富 集培养B组高氏一号培养基下的富集培养C组马铃薯蔗糖培养基下的富集培养第三组A组LB培养基的制备B组连续划线法C组分区划线法第四组A组大肠杆菌的基本形态及运动性鉴 定B组大肠杆菌的生理生化试验