传染性副猪嗜血杆菌病的研究进展2007-7-20 0:00:00 中国兽药114网近年来，国内外无多猪场出现了一种以发性浆膜炎和关节炎及高死亡率为特征，严重危害仔猪和青年猪的传染病，给养猪业带来巨大的经济损失。经细菌分离培养、生化鉴定和分子生物学试验表明，该传染病主要是由副猪嗜血杆菌(HpS)所引起。为了更加全面地、本质地认识该病病原体，本文对其流行病学、理化特性、分子生物学、诊断及防制作了较为全面的综述。同繁殖障碍性传染病、胃肠道传染病一样，呼吸道传染病是危害养猪业的三大症侯群之一。不同的是，由于传统技术和生物技术的应用及对繁殖障碍和胃肠道传染病病原体的研究的深入研究，相继研制出优质高效的疫苗和灵敏特异的诊断方法，使得繁殖障碍和胃肠道传染病暴发流行的态势受到遏制；但是近几年来随着规模化养猪业的发展，呼吸道疾病呈递增趋势，尤其是以多发性浆膜炎和关节炎及高死亡率为特征的传染病给养猪业带来巨大经济损失。因此，有必要对该病原体的研究做出全面的了解，现综述如下：一、流行病学引起猪传染性胸膜肺炎的病原菌有三种，即胸膜肺病炎放线杆菌(AP，过去称为副溶血杆菌HP)、猪嗜血杆菌(Hs)、副猪嗜血杆菌(Hps)。副猪嗜血杆菌自1910年的以来就作为病原菌而被认为是猪Glasser病的病原体。然而，直到九十年代人们才花了较多的精力对其发病和防制进行了研究。该病又称为革拉泽氏病(GassaytSDisease)，可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于58周龄的猪，发病率一般在1015，严重时死亡率司达到50。主要临床症状表现为发热、咳嗽，呼吸困难，消瘦，被毛粗乱，食欲不振，厌食，反应迟钝，疼痛(由尖叫推断)，关节肿胀，跛行，颤抖，共济失调，可视粘膜发绀，侧卧，随之可能死亡。急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产，公猪慢性跛行。即使应用抗菌素治疗感染母猪，分娩时也可能引发严重疾病。因该病造成的哺乳母猪的慢性跛行可能引起母性行为极端弱化。总之，发热、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱是主要的临床症状。肉眼可见的损伤主要是在单个或多个浆膜面，可见浆液性和化脓性纤维蛋白渗出物。这些浆膜包括腹膜，心包膜和胸膜，这些损伤也可能涉及脑和关节表面，尤其是腕关节和跗关节。在显微镜下观察渗出物，司见纤维蛋白，中性粒细胞和较少量的巨噬细胞。副猪嗜血杆菌也可能引起急性败血症，在不出现典型的浆膜炎时就呈现发绀，皮下水肿和肺水肿，乃至死亡。另据报道，副猪嗜血杆菌还可能引起筋膜炎和肌炎，以及化脓性鼻炎等中国兽药114网。早在1910年，德国学者Glasser就发现了副猪嗜血杆菌与猪的多发性浆膜炎和关节炎之间的联系。此后，在大量从临床病料中分离细菌的基础上，人们对副猪嗜血杆菌的研究逐步走向深入。在猪繁殖呼吸综合征、型猪圆环病毒所致疾病(断奶猪多系统衰竭综合征)、伪狂犬病及猪流感等感染之后，这类细菌分离的频率，甚至从浆液性浆膜炎病例中的分离频率一直都在增高。对于猪呼吸道疾病，如支原体肺炎、猪繁殖与呼吸综合征、猪流感、伪狂犬病和猪呼吸道冠状病毒等感染时，副猪嗜血杆菌的存在可加剧病情的临床表现。随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病。由于饲养技术的调整进行不当，以及突发新的呼吸道综合征，使得该病日趋流行，危害日渐严重。近年来，随着养殖水平的提高，副猪嗜血杆菌在我国各猪场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，已从北京、黑龙江、辽宁、河南、湖南、宁夏、湖北、上海、福建、山东、河北等省市分离出副猪嗜血杆菌，其损失相当惨重。如湖南某猪场有母猪240余头，仔猪1000余头，架子猪700余头，1999年4月开始发病，母猪病死率30一40；仔猪有100余头发病，死亡100余头，病死率90以上；架子猪病死率20，经病原分离鉴定、生化试验和动物感染试验，证明是副猪嗜血杆菌感染。按KieleteinRappGabrielson(KRG)血清分型方法，目前副猪嗜血杆菌至少可分为15个血清型，其中在德国4、5型最为流行，在澳大利亚5型、13型最为流行，在美国5型最为流行。研究人员也同时指出，20以上的分离株不能分型。但是，我国的地方分离株虽多次报道，但由于该菌的分离培养和保存极其困难，尚未有人对其进行过全面的生化鉴定，更未进行系统的血清分型研究。除了KRG血清分型方法之外，研究者也尝试用整个细菌体裂解产物进行SDSPAGE电泳，对副猪血杆菌进行分型，结果除KRG血清型1型为SDSPAGEIII型外，其它血清型，如5型、6型、10型均属SDSPAGEI型。副猪嗜血杆菌只感染猪，可以影响从2周龄到4月龄的仔猪和青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于58同龄的猪，发病率可达40，严重时死亡率可达50。细菌通常可从健康猪的鼻腔分泌液中分离出来，还可以从患肺炎猪的肺脏中分离出来。在分离的15种血清型菌株中，1、5、10、12、13、14毒力最强，患猪归于死t_或处于濒死状态；2、4、8、15型为中等毒力，患猪死亡率低，但出现败血症状，生长迟滞；3，6，7，9和11型表现较好，患猪没有明显的临床症状。此外，MorozumiT等研究表明，2亿个副猪嗜血杆菌可使小鼠致死，并能从肺脏中分离出Hps；1亿到16亿个范围的Hps可使豚鼠致死，并能从多个脏器甚至大脑中分离出Hps，从而确立了小鼠和豚鼠町以作为HpS研究模型动物。最近的研究发现，tlpS感染猪时，伴随着急性和慢性肺炎症状。肺泡液中细胞因子发生变化，在支气管接种Hps24小时后，血浆中自介素6的浓度迅速升高，从而影响了血细胞的功能。肺脏的病变及多处器官的损伤严重阻碍了仔猪增重，也改变了育肥猪及肥猪的肉质性状。二、Hps的理化特性副猪嗜血杆菌为革兰氏阴性菌，在巧克力培养基上培养2448小时仍然很差，菌落为光滑型，灰白色透明，直径大约05ram。如果与金黄色葡萄球菌同时培养，副嗜血杆菌在该菌两侧生长良好，菌落直径可达12ram。本菌的生长严格需要V因子，不需要x因子，在血液琼脂上不出现溶血现象。在加DNA、马血清的M96支原体培养基或加DNA、马血清和酵母浸出物的PPLO培养基上生长良好。有人推测，同其他细菌一样，决定Hps毒力和致病性的主要因素是细菌毒素，但这方面的报道较少。有人研究认为，细菌荚膜、外膜蛋白甚至整个细菌蛋白均与细菌毒力有关，至于这些蛋白质的具体功能还存在争议。RuizA等研究表明，外膜蛋白(0MP)与Hps的毒力有关，从健康仔猪与患病猪分离的HpsOMP不同，有多发性浆膜炎和关节炎症状的猪分离的HpsOMP基本相同。OMP蛋白质共有8种，大小分别约为92KD，88KD，53KD，60KD，46KD，37KD，31KD及】5KD。三、HpS分子生物学由于副猪嗜血杆菌引起的多发性浆膜炎、关节炎及仔猪死亡在近几年才受到人们的广泛重视，基础工作如细菌分离鉴定、血清分型等工作尚未完成，所以对其分子生物学研究也并不深入，多数研究仅停留在个别基因的克隆和序列分析方面。DelaquenteRedondoVA等以特异性的PCR方法为基础，建立了限制性内切酶多态性(RFLP)分型方法，他们先克隆了长为19kb的tbpA基因，用TaqI、AvaI和RsaI进行酶切分析，对已知15种血清型的Hps菌株分析结果表明，RFLP敏感性及分型能力均比琼脂扩散方法强，其中RFLP方法为100，而琼脂扩散方法仅为65。此外，学者们还克隆了HpS16srRNA基因、外膜蛋白及脂多糖基因，但具体功能尚不清楚。四、诊断与防制(一)诊断疾病诊断通常建立在畜群病史调查、临床症状和尸体解剖的基础上，细菌的分离培养对确诊是必要的，但往往不能成功，这是因为副猪嗜血杆菌十分娇嫩，相对于标本中同时可能出现的其它细菌，难以满足其生长需要。据报道，采用回归分析法分析，副猪嗜血杆菌真实的发病率可能为实际确诊的10倍之多，部分原因是由于不能确认采集来的标本中是否存在副猪嗜血杆菌。研究人员不仅要对有严重临床症状和损伤的猪进行尸体剖检，还要对处于疾病急性期的猪在应用抗菌素之前采集病料进行细菌的分离鉴定，细菌分离培养最好选择浆膜表面物质或渗出的脑脊髓液及心脏血液，即使损伤轻微或不明显也要这样做。尽管常规诊断有些困难，但在加有抗菌素的选择培养基上接种以后，用特殊的稀释技术可成功地在从呼吸道采集来的标本中培养出大量细菌。现在，华中农业大学动物病毒室已建立了副猪嗜血杆菌的快速聚合酶链式反应(PCR)诊断技术，可对该病作出迅速的诊断。用生物化学的检测方法可将副猪嗜血杆菌从其经NAD或V因子依赖的微生物中鉴别开来。有时其它的NAD依赖的细菌(L类嗜血杆菌，猪放线菌，吲哚放线菌)会被误认为嗜血杆菌，这些细菌在鼻窦，扁桃体或肺脏中大量存在，但只有较低的致病力。在一个猪群中出现副猪嗜血杆菌的几个菌株或血清型并非少见，甚至在单个猪上的不同标本中也可发现不同的菌株或血清型。由此，全身各处或大损伤点分离是唯一能保证所分离出来的细菌在病程中发挥作用的前提。在血清学的实验室诊断方面，主要通过琼脂扩散试验、补体结合试验和间接血凝试验等。血清学的分型严格要求研究者熟知疾病暴发的流行病学，以及感染和接种的免疫反应，这只有少数几个实验室中才能做到。鉴别诊断要将副猪嗜血杆菌与败血性细菌感染相区别，能引起败血性感染的细菌有链球菌、猪丹毒丝菌、猪放线杆菌、猪霍乱沙门氏菌、胸膜肺炎放线杆菌以及埃希氏大肠杆菌等。另外，3一10周龄猪的支原体多发性浆膜炎和关节炎能出现与副猪嗜血杆菌感染相似的损伤。只有熟悉了其它病毒和细菌病原之后，才能认清副猪嗜血杆菌在支气管肺炎中的作用，这些病原体可能在多因子疾病的病程中产生影响。(二)治疗抗生素预防或口服药物治疗对严重的副猪嗜血杆菌暴发可能无效。一旦临床症状已经出现，应立即采用口服之外的方式应用大剂量的抗菌素进行治疗，并且应当对整个猪群药物预防，而不仅仅只是对那些表现出症状的猪用药。可以选用青霉素治疗，但有报道说，细菌对青霉素的抗药性日渐增强。大多数副猪嗜血杆菌也对阿莫西林、氟喹诺酮类、头孢菌素、四环素、庆大霉素、氟甲砜霉素和增效磺胺类药物敏感，但大多菌株对红霉素、氨基甙类、壮观霉素和林可霉素有抵抗力。(三)免疫鉴于1周龄前的仔猪鼻粘膜就有可能有副猪嗜血杆菌的寄生，因而仅通过早期断奶来消除该菌是不可能取得成功。通过抗菌素来控制因感染副猪嗜血杆菌而引起的疾病，结果往往得不偿失。将副猪嗜血杆菌彻底消除出猪群也许并不可取，因为在这之后混养于无病原菌猪群的带菌猪和生产后期潜伏有副嗜血杆菌的猪，可能引起全群猪发病，造成毁灭性的经济损失。向一个猪群中引人健康状况不同的新猪群时，应当隔离饲养并维持一个足够长的适应期，以使那些没有免疫接种但有感染条件饲养的猪群建立起保护性免疫力。母代的免疫力和天然的免疫力是控制疾病过程的关键因素。预先让猪接触无致病力的副猪嗜血杆菌株，以培养其对后来的有毒菌株刺激的抵抗力。母猪接种后可对4周龄以内的仔猪产生保护性免疫力，这时再用含相同血清型的灭活苗激发仔猪的免疫力，对断奶仔猪产生保护性免疫力。由于该菌的败血症特性，抗体很可能是保护性免疫的主要困素。疫苗的使用是预防副猪嗜血杆菌造成损失的最为有效的方法之一，疫苗在西班牙、澳大利亚、加拿大和美国应用极为广泛。在我国，华中农业大学动物病毒室已成功研制出副猪嗜血杆菌多价油乳剂灭活苗。其接种方法为：母猪产前46周、仔猪l周龄、34周龄各接种一次，公猪一年两次免疫接种即可。大量报道指出，通过商业疫苗接种或使用特异性灭活菌苗(自家组织苗)，可以成功地控制该病的发生，但也有少数使用灭活菌苗预防失败的事例，这可能是由于病程中出现的菌株血清型不同而缺乏交叉保护。已有的资料表明，副猪嗜血杆菌具有明显的地方性特征，疫苗免疫在不同的血清型之间所引起的交叉保护率很低。因此