第七章 微生物的生长及其控制生长：生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。个体生长 个体繁殖 群体生长群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖微生物生长：在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长） 第一节 微生物生长的测定个体计数群体重量测定群体生理指标测定微生物生长： 单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的增加。微生物生长的测定： （一） 以数量变化对微生物生长情况进行测定计算微生物繁殖出的个体数目1、培养平板计数法：广泛用于各种样品的检测 涂布法(the spread plate method)、混匀浇注法（the pour plate method）。优点：常用、较准确、可对不同种微生物做活菌计数。缺点： 时间长、人为误差大，有机械损伤。一个菌落可能是多个细胞一起形成，一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。2、膜过滤培养法当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。3、The most probable number method（液体稀释法）对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算出样品中的微生物数目。主要适用于只能进行液体培养的微生物，或采用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数的微生物。4、显微镜直接计数法1） 常规方法：采用细菌计数板或血球计数板（Hemocytometer），进行计数，即将一定稀释度的细胞悬液加到固定体积的计数器小室内，在显微镜下观察小室内细胞的个数，计算出样品中微生物细胞的浓度。2） 其它方法：比例计数、过滤计数、活菌计数（二） 以生物量为指标测定微生物的生长1. 比浊法：根据在一定的浓度范围内，菌悬液的微生物细胞浓度与液体的光密度成正比，与透光度成反比。菌数越多，透光量越低。在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density, 即O.D.)表示菌量。2. 重量法以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；方法：洗涤、离心、烘干、称重。 特点：用于菌浓度高的样品，直接、可靠、准确通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；3. 生理指标法微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。 第二节 细菌的群体生长微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础。一、单细胞微生物的典型生长曲线分批培养（batch culture） ： 指微生物在一定容积的培养基中，在特定培养条件下只完成一个生长循环（最后一次收获）的培养方法。（封闭系统） 生长曲线(Growth Curve)：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实践曲线将少量单细胞微生物接种到定量的液体培养基中，在适宜的温度、通气等条件下，该群体就会由小到大，发生有规律的增长，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数（细胞数目的对数）为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线（细菌繁殖曲线）。细菌是单细胞微生物，细菌的繁殖也就是群体的生长，所以，繁殖曲线又称生长曲线。根据微生物生长速率常数（每小时的分裂代数）的不同，一般可将一条典型的生长曲线至少可以分为 迟缓期(Lag phase)，对数期(Log phase)，又称指数生长期(Exponential phase)，稳定期(Stationary phase)和衰亡期(Decline或Death phase)等四个生长时期。1. 迟缓期(Lag phase)：将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。迟缓期的特点：分裂迟缓、代谢活跃迟缓期出现的原因：调整代谢t 细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大t 细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。t 对外界不良条件反应敏感。在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：(1) 通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；(2) 利用对数生长期的细胞作为种子；(3) 尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；适当扩大接种量。2. 对数生长期(Log phase)：又称指数生长期(Exponential growth phase)延迟期末，细菌已适应了新环境，细胞开始以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈几何级数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。这时期称为对数生长期。对数生长期微生物的生理特征有：平衡生长，细胞的大小、组成、生理特征等均趋于一致； 酶系活跃、代谢旺盛；生长速率常数R最大、代时最短、稳定。 意义：（）代谢、生理研究的好材料；（）生产中用其作种子在对数生长期有三个重要参数：繁殖代数（n）、生长速率常数（R）、代时(G )（1）繁殖代数（n） 根据一定时间内细菌的增殖数量可以计算出繁殖的代数（n）。2n=X2/X1 n lg2=lgX2-lgX1n =（lgX2-lgX1）/lg2 =3.322（lgX2-lgX1）（2）生长速率常数（R）：即每小时分裂次数R= n / t2-t1 =3.322（lgX2-lgX1）/t2-t1 （3）代时(G )在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generation time，G)。G= 1/R=t2-t1/3.322（lgX2-lgX1） G=（t2-t1）/n=lg2（t2-t1）/lgX2-lgX1 在群体生长里，细胞数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doubling time)。影响微生物增代时间（代时）的因素1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短；3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比；凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。3. 稳定生长期(Stationary phase)：稳定生长期又称恒定期或最高生长期。由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零。稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。特点: 生长速率趋于0； 细胞的菌体形态典型； 芽孢形成，细胞内开始贮藏物质。出现原因： 1）营养物质大量消耗； 2）有毒代谢产物大量积累； 3）外界条件影响（pH、高细胞浓度，氧化还原电位等）意义：1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等）， 生产上应尽量延长此期，提高产量 措施如下： 补充营养物质（补料） 调pH 调整温度 2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高4. 衰亡期(Decline或Death phase)：营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如抗生素等。 在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。二、连续培养(Continous culture ) 又称开放培养(Openculture)。连续培养在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。故要在分批培养的基础上,引入有效的营养物补充和代谢物排出的控制装置。连续培养的控制方式主要有两类：恒化培养（Chemostatic culture）和恒浊培养（Turbidostatic culture）三、同步培养(Synchronous culture) 同步生长：运用同步培养技术，控制微生物生长，使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，这种生长状态称为同步生长 (synchronous growth) 。同步培养(Synchronous culture)：使群体中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于同一阶段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。同步培养（物）：通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物。获得同步生长的手段主要有两种：环境条件控制技术和选择法。 温度培养基成份控制其他（如光照和黑暗交替培养）环境条件控制技术（诱导法） 离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法机械方法（选择法）第三节 微生物的培养方法纯培养（pure culture）： 单个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。一、固体培养(Solid-state culture)（一）实验室常见的固体培养1. 好氧菌培养对于好氧的微生物，必须提供有氧的环境中培养。试管斜面(test-tube slant)培养皿平板克氏扁瓶(kolle flask)茄子瓶斜面2. 厌氧菌培养培养厌氧微生物时，必须除去培养基中的氧气或使氧化还原电势降低，并在培养过程中一直能保持与外界氧隔绝，这样才能促使厌氧微生物的生长。厌氧菌培养的装置：（1）Hungate滚管技术：1950年美国微生物学家R.E.Hungate设计原理：利用除氧铜柱来制备高纯氮去驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下。培养基：预还原无氧灭菌培养基（PRAS培养基，prereduced anaerobically sterilized medium）滚管技术的优点：试管口与空气接触面积小；经滚动后，试管的内表面上有大面积的固体培养基可供长出单菌落。 （2）厌氧培养皿（3）厌氧罐：方法：装入待培养物；密闭罐盖抽真空灌氮抽真空灌氮抽真空灌混合气（N2CO2H2=801010，V/V）（4）厌氧手套箱: （N2CO2H2=85515，V/V）（二）生产中常见的固体培养1. 好氧菌的曲法培养曲盘、转鼓、通风曲槽等2. 厌氧菌的堆积培养法 二、液体培养(Liquid-state culture)液体培养提高溶氧速率的措施：1. 浅层培养(Shallow liquid culture)2.摇床:振荡培养(Shaking flask