BRCA2与LIM结构域蛋白FHL2的相互作用 作者：白玉杰，Seetha SV， Vamla B, 高庆生【关键词】 乳腺肿瘤Interaction between BRCA2 and the LIM domain only protein FHL2【Abstract】 AIM: To screen genes encoding proteins which can interact with BRCA2 via yeast twohybrid system, confirm the interaction and analyze their functional linkage. METHODS: 3region of BRCA2 gene was used to construct the “bait” plasmid and to screen the cDNA library of normal human mammary gland. Coimmunoprecipitation, mammalian twohybrid and Luciferase assay were used to analyze the association and putative function. RESULTS: Many genes encoding proteins interacting with BRCA2, including the FHL2, were pulled out by yeast twohybrid screening. The in vivo binding and functional relation between BRCA2 and FHL2 was demonstrated coimmunoprecipitation, mammalian twohybrid assay and luciferase detection. CONCLUSION: The interaction and the functional linkage between BRCA2 and FHL2 was confirmed and which provides fresh insights into the biological functions of BRCA2.【Keywords】 breast neoplasms; genes, suppressor, tumor; BRCA2; yeast twohybridization; FHL2;【摘要】 目的： 应用酵母双杂交方法筛选BRCA2相互作用蛋白编码基因，验证其相互作用并研究其功能联系. 方法： 以BRCA2基因 3端片段构建酵母双杂交质粒，筛选正常人乳腺上皮细胞cDNA文库，获得编码相互作用蛋白的基因，采用免疫共沉淀、哺乳细胞双杂交和荧光酶测定等方法进一步验证蛋白间相互作用和功能联系. 结果： 采用酵母双杂交系统筛选，获得了多个编码BRCA2相互作用蛋白的基因，其中包括已知的FHL2蛋白；免疫共沉淀和哺乳动物细胞双杂交试验显示BRCA2和FHL2在体内特异性结合，并证实FHL2在体内形成同源二聚体；转录活性分析发现BRCA2与FHL2有协同转录激活作用. 结论： 发现BRCA2与FHL2蛋白间相互作用和功能联系，为BRCA2功能研究提供了新的方向.【关键词】 乳腺肿瘤；基因，抑制，肿瘤；BRCA2；酵母双杂交；FHL20引言乳腺癌是西方妇女最常见的恶性肿瘤，发病率约为10%1，死亡率高达30%2. 我国发病率低于西方国家，大约2%-3，但近年来呈快速上升趋势，在上海、天津及沿海地区已成为女性发病率最高的恶性肿瘤3. 目前研究最多的遗传因子是乳腺癌抑制基因BRCA14和BRCA25，6. BRCA2基因突变携带者发生乳腺癌、卵巢癌及胰腺癌的危险性显着高于正常人群7，BRCA2参与双链DNA断裂损伤修复、维持染色体稳定、转录调控等细胞功能 8-10 . FHL2是1998年Chen等从胎儿心脏cDNA文库克隆的一个单纯LIM结构域蛋白，含4个半LIM结构域而得名.我们采用酵母双杂交系统筛选正常人乳腺上皮细胞文库，发现FHL2是BRCA2相互作用蛋白之一，不仅哺乳细胞双杂交证实了体内结合，而且还发现二者有转录激活协同作用，为BRCA2和FHL2的功能研究提示了新的方向.1材料和方法1材料HA109酵母细胞；酵母双杂交系统3全套质粒；哺乳细胞双杂交系统质粒(pM, pVP16, pM53, pVP16T, pVP16cp）；酵母培养基及筛选培养基、多种氨基酸、XGal, XGal, LB培养基、酵母质粒DNA提取kit等购自CLONTECH 公司；293T细胞购自ATCC.方法酵母双杂交系统钩质粒的构建以pUC19/BRCA2质粒为模板，采用Stepdown PCR扩增BRCA2 3片段，并掺入限制性酶切位点, 扩增产物经10 gL-1琼脂糖凝胶电泳分离，采用DNA回收试剂盒(Qigene公司，美国)回收PCR产物片段及载体pGBKT7质粒DNA. 连接、转化大肠杆菌DH5感受态细胞，含卡那霉素的LB培养板培养、筛选阳性克隆、提取质粒DNA进行酶切鉴定、序列分析证实.酵母双杂交系统筛选参照MATCHMAKER GAL4双杂交系统3操作流程进行(MATCHMAKER GAL4 TwoHybrid System3 & Libraries User Mannual. PT32471, Clontech, USA).哺乳细胞双杂交方法验证BRCA2/FHL2体内结合将BRCA2/C3片段及FHL2基因分别克隆到哺乳细胞双杂交载体pM和pVP16中，Ca32沉淀法转染293T细胞，CO2孵箱37培养48 h，收集细胞，采用荧光酶检测试剂盒检测转染细胞的荧光酶活性.免疫共沉淀法分析FHL2与BRCA2的体内结合分别构建表达含Flag标签的C3和含Myc标签的FHL2的真核载体pEF/BRCA2C3flag (pEF/BRCA2C1/C2两个质粒编码较短的C端片段作为对照)和/FHL2myc, 各用10 g氯化铯纯化的质粒DNA，磷酸钙沉淀法转染293T细胞. 48 h后收集细胞,用含10 gL-1 FMSF的LSAB缓冲液溶解，振荡、离心取上清，加入10 mgL-1 抗Flag单克隆抗体4孵育过夜， 加入蛋白G微珠, IP缓冲液(50 mmolL-1 TrisHCl , 150 mmolL-1 NaCl, 5 mgL-1 NP40,gL-1 BSA, 10 mgL-1 PMSF)漂洗6次, 90 mgL-1 SDSPAGE电泳，转移到尼龙膜，用辣根过氧化物酶偶联抗Myc单克隆抗体进行Westernblot反应，ECL系统检测.对BRCA2基因的转录激活作用pM/FHL2, pEF/BRCA2真核表达载体和pG5luc荧光酶报道质粒共转染293T细胞，CO2孵化37培养48 h，用荧光酶检测试剂盒测定转染细胞的荧光酶活性.2结果酵母双杂交筛选质粒的构建pUC19/BRCA2质粒为模板，Stepdown PCR条件为：94 1 min， 68/65/62/59/56 1 min, 72 2 min 各5个循环，随后94 1 min，55 1 min，72 2 min 进行20个循环. PCR产物经10 mgL-1琼脂糖凝胶电泳检测，特异性扩增产物分子质量(Mr103)约为2900，与设计扩增大小相符. PCR产物与经酶切pGBKT7, pGADT7质粒，经连接转化、提取质粒DNA，双酶切鉴定阳性重组质粒，序列测定证实正确.2cDNA文库的酵母双杂交筛选用pGBKT7/ C3酵母双杂交钩质粒筛选正常人乳腺细胞cDNA文库，转化效率为106107 cfug-1 DNA，筛选获得阳性克隆68个，BLAST分析在24种已知基因中，包括编码FHL2蛋白的基因全长序列.3哺乳细胞双杂交分析pM/C3，pV16/FHL2, pM/FHL2, pV16/C3各10 g；荧光酶表达报道质粒pG5luc 2 g共转染293T细胞, 通过检测荧光强度分析蛋白间的相互作用，结果表明FHL2与BRCA2C3片段特异性结合；FHL2有自身的内在转录激活作用. 而且，FHL2在细胞形成同源二聚体结构.图1哺乳细胞双杂交验证FHL2与BRCA2C3片段的体内相互作用(略)与BRCA2体内结合反应采用免疫共沉淀和Westernblot进一步证明了FHL2与BRCA2体内结合. 转染FHL2myc或/和 BRCA2C3flag质粒的293T细胞裂解液，采用抗Flag抗体免疫共沉淀，抗Myc抗体Westernblot检测，发现FHL2myc和BRCA2C3flag在体内形成复合物，而与较短的BRCA2片段C1, C2不结合或仅有微弱结合， 证实了二者间在体内的特异性结合.图2FHL2与BRCA2的体内结合(略)与BRCA2转录激活协同作用文献报道FHL2蛋白具有转录激活作用，BRCA2的N端25-105 aa是转录激活结构域. 在293T细胞共转染FHL2和全长BRCA2表达质粒各2 g, 报道质粒pSG5luc 1 g，48 h后检测转染细胞的荧光酶活性，单独转染pM/FHL2细胞=1134; pM/FHL2、PCR/BRCA2共转染细胞升高为，表明FHL2和BRCA2 有转录激活协同作用(Fig 3).图3BRCA2和FHL2在293T细胞的协同转录激活作用(略)3讨论家族遗传性乳腺癌患者约占发病总数的5%-10%，其中40%-60%有BRCA1或BRCA2基因的突变. 临床发现大部分BRCA2基因突变导致蛋白C端的缺失，同时BRCA2 蛋白C端有与RAD51相互作用结构域和细胞核定位信号, 推测BRCA2的C端在乳腺癌发病中可能发挥重要作用. 因此我们选择编码C端的基因片段构建酵母双杂交质粒，从正常乳腺上皮细胞cDNA文库筛选编码相互作用蛋白的基因或基因片段，以研究BRCA2的生物功能及在乳腺癌发病中作用.酵母双杂交技术是目前用来研究蛋白间相互作用的重要工具，其最常见的问题假阳性，影响了筛选效率和准确性. 本文采用的酵母双杂交系统3中，报道酵母菌株AH109含由GAL4上游活化(UASs)和TATA盒控制的3种报道基因，大大减低了假阳性. MEL1是一种可分泌酶，可用XGal直接在培养基筛选阳性克隆，简化筛选操作，提高了筛选效率. 除了采用较好的双杂交系统外，高转染效率是筛选成功的关键因素之一，当转染效率低时极少获得阳性克隆.FHL2最初在心肌细胞发现，主要参与心肌细胞分化及细胞生长调控，随后发现FHL2具有转录激活作用，是Wilms肿瘤抑制基因11和雄激素受体12 等的共活化因子，在生殖器官分化、发育中起重要调控作用. 我们首次发现和鉴定了FHL2与BRCA2的相互作用，并发现BRCA2可增强FHL2的转录激活作用. FHL2是雄激素受体的共转录激活因子，FHL2可能影响男性乳房发育，而BRCA2基因缺陷与男性乳腺癌发生相关，推测FHL2与BRCA2的相互作用在男性乳腺癌发病中可能发挥重要作用. 因此，本文不仅为BRCA2也为FHL2蛋白功能的研究带来新的曙光，为探讨乳腺癌发病机制提供了新的方向.【参考文献】1 Kelsey JL, HornRoss PL. Breast cancer: Magnitude of the problem and descriptive epidemiology J.