大肠杆菌非中断杂交实验一、实验目的1了解细菌有性杂交的原理，学习合作实验，熟悉点菌。2掌握利用非中断杂交法进行基因定位的原理，并利用实验结果进行分析。二、实验原理F+菌株：带有F因子的菌株F-菌株：不带F因子的菌株Hfr品系：F因子整合入细菌染色体F菌株：由Hfr菌株染色体中F因子的不正常环出造成F因子含有供体细胞的特定基因其中，带有F因子的菌株能够与不带F因子的菌株（F-菌株）进行杂交进而发生基因重组。F因子一般游离于细菌染色体之外，也可能整合到染色体上，因此是一种被称为附加染色体的质粒。带有F因子的细菌，细胞表面会形成一种与细胞接合作用相关的毛状突起，被称为性纤毛，长约l-20ym。性纤毛促使供体和受体细胞特异地配对，在受体细胞上有纤毛的特异结合位点，当性纤毛结合到这些特异性位点之后，开始收缩并将2个细菌拉拢形成作为遗传物质转移通道的接合管，遗传物质的转移就开始了。F+菌株和F-菌株杂交发生基因重组的频率约为10-7；Hfr品系，其和F-菌株杂交时发生重组的频率为10-4；通过F因子介导的供体菌向受体菌特定基因的转移被称为性导。在杂交过程中，接合细菌可以在2小时中缓慢地进行遗传物质的传递，在杂交不同时间进行强力搅拌，打断接合细菌之间的接合管，从而终止遗传物质的转移。所以对应于转移起点越近的基因进入受体菌的几率越大，因此可以通过绘制基因的转移曲线推断出基因顺序并以时间为单位进行染色体作图，这种方法就是中断杂交作图。本实验采用的是非中断杂交，不同的高频重组品系（Hfr）中F因子与主染色体的整合位置是不同的。Hfr菌株与F-菌株进行结合，染色体由Hfr向F-转移，由于染色体的转移是单方向性的，染色体上的基因都是连锁的，所以，位于Hfr染色体上前面的基因将有更多的机会出现在F-中，越是后端的基因出现的机会就越少。因此，根据细菌结合后F-菌中Hfr上的基因出现的多少就可以测定基因间的相对位置。实验中采用选择培养基筛选法，即亲本不能生长，只有重组子可以生长，同时可利用营养物的加入选择不同的重组子。三、实验用具及材料1）菌株供体菌：E.coliCSH60Hfrstrs受体菌：E.coli57BF-缺陷型met-leu-trp-his-arg-lac-gal-ade-ilv-strr2）实验试剂及培养基1. 液体BP培养基，10xA磷酸缓冲液，生理盐水，200.0g/L糖溶液，0.25M硫酸镁溶液,盐酸硫胺素（VBI）,链霉素溶液，氨基酸溶液及腺嘌吟2. 平板培养基：见表1。表1培养基配表培养基选择标记碳源StrArgIlvMetLeuAdeTrpHisAmetleustr葡萄糖+一一+Barg(metleustr)葡萄糖+一+一一+Cade(metleustr)葡萄糖+一一一+Dtrp(metleustr)葡萄糖+一一+一+Ehis(metleustr)葡萄糖+一一+一Flac(metleustr)乳糖+一一+Ggal(metleustr)半乳糖+一一+将培养基配制完成后，在超净工作台将培养基倒入培养皿内制成平板，待培养基冷凝后备用。3）其他用具三角瓶、试管、烧杯、培养皿、取液器、接种环、涂棒、牙签、体积分数70%酒精。四、实验操作1. 活化菌种：实验前，从冰箱内取出保存的受体及供体菌种在37C下活化24h,然后分别用接种针挑一环菌至5mLBP液体培养基中在37C、200r/min下震荡培养16h。2. 扩大培养：从上述5mL培养液中用取液器分别吸取供体和受体菌1mL装入到另一新的5mL培养基内，在37C下培养23h。此时，从供体和受体的培养瓶中分别取O.lmL菌液均匀涂布在A平板培养基上作为对照。将培养皿置于37C恒温培养箱倒置培养。3. 杂交：用取液器从扩大培养后的菌液中分别吸取供体菌0.2mL、受体菌4mL混合于一个三角瓶内，将其置于摇床37C、200r/min下震荡培养1.5h。4. 杂交菌液培养：杂交结束后，从杂交液中吸取0.1mL到A培养皿上，用涂棒将杂交液涂布均匀。5. 稀释涂布：分别涂布两个稀释5倍和10倍的A平板培养基，置于37C温箱倒置培养。6. 用无菌的牙签挑取A平板上的菌落，分别接种在BG选择培养基的对应位置上，最后在选择培养基上接种的菌落数达到110。7将接种好的选择培养基平板置于37C下恒温培养，待有菌落长出时，进行统计。根据统计结果将大肠杆菌的几个连锁的基因作出线性排列的位置顺序图。五、结果与讨论1.实验结果表1实验结果培养基B(arg)C(ade)D(trp)E(his)F(lac)G(gal)总数生长菌数8-12613581221211258-2253修正为315107修正为106110总数41146613229227235重组率0.0170.4850.2810.0550.9740.9661附:重组率=（选择性培养基生长菌数/点总菌数）X100%D板戳的洞很大，计数时偏大，修正为31。G板我们的菌落数很少，和其他组结果都有所不同，估计是点菌时没有点上，修正为110。2.计算基因间的图距由于图距与重组率的倒数有较好的线性相关关系，由此以ori到lac的图距定义为1，则计算如下表2相对图距的计算基因lacgaladetrphisArg重组率0.970.970.490.280.060.021/重组率1.031.042.063.5618.0858.75相对图距1.001.012.013.4717.6257.253. 绘制大肠杆菌连锁基因图由表1得到arg，ade,trp,his,lac,gal,met和leu从近到远的排列顺序为：（met-leu）-lac-gal-ade-trp-his-arg，并由表二得各基因相对图距作大肠杆菌连锁基因图如下：ori803020Z_pyrCPF恵斗40而后面的基因因为，这种计算方法不是那么InsertedFplasmid7000600大肠杆菌的遗传图示60U.O為Oo0)080图1实验得到的大肠杆菌连锁基因结果评价：（用遗传书的Figure15.16作对照。）由图可见，前面的基因相对位置较为符合，适合，所以应该选择不同的Hfr实验。5. 关于非中断杂交和中断杂交：中断杂交是比较普遍的用于测定大肠杆菌基因分布的方法，它的操作相对复杂，但是能得到更准确的结果。右图是一个中断杂交实验的结果图：由于染色体是线性传导的，假设传导速度一样，那么横坐标时间就和基因相对O点的位置成正比。而非中断杂交的结果，其实相当于纵坐标，即足够长的时间后进入并与标记基因一起重组的概率，这个概率也是和图距正相关的。一种由非中断杂交得到图距的计算方式，是直接用1减去重组率，以右图的横纵坐标对照可知，这样计算结果误差较大，于是实验采用的是1/重组率法。不管是中断杂交，还是非中断杂交，都存在两个基因相距太近时和基因离O点太远时测量不准的问题，前者可以通过重组进行精细定位，后者可以通过不同Hfr菌株配合实验得到较准确的结果。六、实验结果这个实验可以说是在别的实验中“插空”做的，但，20*配置培养基等准备工作。这一步是最简单的，很好地体现了大合作的特点，E人做了什么就只知道个大概了。*杂交，涂A板。中断10203040Time(minutes)这一步要求无菌操作，我们使用的是酒精灯提供局I菌的，无菌的也不要碰无菌的”，对于这次实验而言，由菌操作意义不是那么大，但是作为对无菌操作的一次练习器内应该考虑为有菌，而所有可以和外界空气接触的部分就算有菌了；其次操作过程中不仅仅是不碰，最好有菌的东西都不要直接经过无菌的上方；最后，一切无菌操作需保持在酒精灯有效范围内，但又要注意塑料制品不可靠火焰太近。*点菌、统计。点菌的时候几乎没有考虑无菌环境，因为培养基内有抗生素，不担心细菌污染，而真菌如果要生长的话需要时间较长，而我们的实验3天就可以看结果了。点菌要注意的是牙签不要插得太深，否则计数时会搞不清是牙签印还是菌落。但是又要保证碰到，不然可能没有点上。一根牙签要点六块板，点到后三块时菌浓度肯定更低了，所以要用牙签的另一面点菌。因为是统计数据，所以不需要太严格地一根牙签点六块板，但是从误差分析角度考虑，这样点误差要相对小一些。统计的时候一定要四个人一起，在有疑问的时候才能更好地讨论。我们的经验是，反面不确定就看正面侧面，从多个角度观察，菌落会比较潮湿而且稍微比培养基高，还是可以和牙签印分开的；对于长了霉菌的也是用这个方法，霉菌菌落的形态和大肠杆菌是不同的，仔细从不同角度观察可以判断霉菌菌落旁有没有盖着大肠杆菌菌落。七、思考1什么是高重组品系？答：F+菌株和F-菌株杂交将产生F+菌株后代（约70%）,而发生基因重组的频率为10-7。当F因子整合入细胞染色体的时候，产生了高频重组的Hfr品系，高频重组品系和F+菌株有相似的杂交特性，但和F-菌株杂交时发生重组的频率为10-4，并产生后代为F-菌株。2以大肠杆菌为例说明原核生物与真和生物基因传递和重组的异同。答:相同点：都是异源DNA进入细胞的过程。不同点：原核细胞传递基因主要靠三种方式：转化、接合、转导。真核生物有两种：亲代和子代间靠减数分裂和受精作用，外源基因转入一般发生在病毒感染过程中。基因重组方面，原核细胞与真核细胞的DNA重组都发生在同源区段，以利配对。但原核生物的基因重组发生的时间比较随意，重组率低；而真核生物的基因重组需要发生在特定的细胞时相（减I前期的交叉互换，及减I后期的自由组合），并且重组率相对较高。此外，大肠杆菌重组形成部分二倍体或部分合子，且只有偶数次交换才能产生平衡的重组子，相反的重组子不会出现。3如何证明细菌重组是由杂交产生的，而不是由回复突变产生的？答：在杂交之前将两个亲本各涂这样一组板作为contro1,结是这两个亲本在AG培养基上都不生长，即可证。4如何证明细菌的接合是异宗配合？答：可准备两组杂交，如a.F+lac+:F-lac-;b.F+lac+：F-lac-，结果a.lac+，b.lac-就说明配合过程中，基因只从“雄性F+”细菌传递到了“雌性F-”细菌，而不能按相反的方向传递。5. F+菌株Hfr菌株分别与F-菌株杂交产生重组频率不同的原因是什么？答：对HfrXF-接合来说，早转移到受体菌内的DNA立即与受体染色体上同源区段发生重组，因此重组频率很高。而对于F+XF-来讲，与质粒序列同源的区段较少，因此不容易发生重组。6. 在杂交中，为什么杂交液中受体菌的浓度远大于供体菌的浓度？答：保证供体足够量，使每个供体细胞有同等机会和受体结合，使供体菌株有较高结合频率。八、参考文献1. Genetics:FromGenHe.sHtaortGweenlolmeest.Al2. 遗传学实验指导张贵友等编清华大学出版社