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蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G250法)一、目的蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一,承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础,也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质,提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G250法是比色法与色素法相结合的复合方法,简便快捷,灵敏度高,稳定性好,是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量的原理,了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。二、原理考马斯亮蓝G250是一种染料,在游离状态下呈红色,当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在01000g范围内,蛋白质一色素结合物在 595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用比色法测定。三、仪器、试剂和材料1仪器 (1)分析天平 (2)具塞刻度试管 10ml 8 (3)吸管 0.lmlI,lmlZ,5mlI (4)研钵 (5)漏斗 (6)离心管 10ml (7)容量瓶 10ml (8)离心机 (9)721型分光光度计2试剂 (1)标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至100ml,制成 100 pgml的原液。 (2)考马斯亮蓝G250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G250,溶于50ml 90乙醇中,加入 85(mv)的磷酸 100ml,最后用蒸馏水定容到 1000ml。此溶液在常温下可放置一个月。3材料 绿豆芽四、操作步骤1标准曲线的制作 取6支具塞试管,编号后,按下表加入试剂。管 号操作项目 1 2 3 4 5 6标准蛋白质溶液(ml) 0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0G-250试剂(ml) 各5蛋白质含量(g) 0 20 40 60 80 100盖上塞子,摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定(比色应在 l h内完成)。以牛血清白蛋白含量(g)为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘出标准曲线。2样品中蛋白质含量的测定(1)准确称取约200mg绿豆芽下胚轴,放入研钵中,加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆,离心(4000rmin,10min),将上清液倒入10ml容量瓶,再向残渣中加入2ml蒸馏水,悬浮后再离心10min,合并上清液,定客至刻度。(2)另取1支具塞试管,准确加入0.l ml样品提取液,再加入0.9 ml蒸馏水,5ml考马斯亮蓝G250试剂,充分混合,放置2min后,以标准曲线1号试管做参比,在595 nm波长下比色,记录吸光度。五、结果处理根据所测样品提取液的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(g),按下式计算: 样品蛋白质含量(gg鲜重)(查得的蛋白质含量(g)提取液总体积(ml)(样品鲜重(g)测定时取用提取液的体积(ml)六、注意事项 比色应在出现蓝色2 minl h内完成。作者:吕淑霞 来源:生物秀 时间:2008-5-21一、目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。二、原理考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry 法还高4 倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为01 000gmL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。二、材料、主要仪器和试剂1实验材料新鲜绿豆芽2主要仪器(1)分析天平、台式天平(2)刻度吸管(3)具塞试管、试管架(4)研钵(5)离心机、离心管(6)烧杯、量筒(7)微量取样器(8)分光光度计3试剂(1)牛血清白蛋白标准溶液的配制:准确称取100mg 牛血清白蛋白,溶于100mL 蒸馏水中,即为1 000gmL 的原液。(2)蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制:称取100mg 考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90乙醇中,加入85(WV)的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。(3)乙醇(4)磷酸(85)四、操作步骤1标准曲线制作(1)0100gmL 标准曲线的制作:取6 支10mL 干净的具塞试管,按表1 取样。盖塞后,将各试管中溶液纵向倒转混合,放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色,记录各管测定的光密度OD595nm,并做标准曲线。表1 低浓度标准曲线制作(2)01 000gmL 标准曲线的制作:另取6 支10mL 具塞试管,按表2 取样。其余步骤同(1)操作,做出蛋白质浓度为01 000gmL 的标准曲线。表2 高浓度标准曲线制作2样品提取液中蛋白质浓度的测定(1)待测样品制备:称取新鲜绿豆芽下胚轴2g 放入研钵中,加2mL 蒸馏水研磨成匀浆,转移到离心管中,再用6mL 蒸馏水分次洗涤研钵,洗涤液收集于同一离心管中,放置0.51h 以充分提取,然后在4 000r/min 离心20min,弃去沉淀,上清液转入10mL 容量瓶,并以蒸馏水定容至刻度,即得待测样品提取液。(2)测定:另取2 支10mL 具塞试管,按下表取样。吸取提取液0.1mL(做一重复),放入具塞刻度试管中,加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂,充分混合,放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色,记录光密度OD595nm,并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X(g)。以标准曲线1 号试管做空白。五、结果计算式中:X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量(g)。六、附 注1Bradford 法由于染色方法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高,现已广泛应用于蛋白质含量的测定。2有些阳离子,如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定,但大量的去污剂如TritonX-100、SDS 等严重干扰测定。3蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分迅速,在2min 左右反应达到平衡;其结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测定时,不可放置太长时间,否则将使测定结果偏低。七、思考题1制作标准曲线及测定样品时,为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合?参考答案1将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分,并且使整个反应液均一,否则在比色测定时,结果会有较大偏差,使标准曲线的制作不标准,后续的测定结果就不可靠。蛋白质含量测定的方法(Bradford 方法)原理:这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下,可配成淡红色的溶液,当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳定。反应化合物在465-595nm处有最大的光吸收值,化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系,因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。溶液:1)Bradford储存液 100ml95%乙醇 200ml88%磷酸350mgServaG蓝 室温下长期保持稳定。2)Bradford工作液 425ml双蒸水 15ml95%乙醇 30ml88%磷酸 30ml Bradford储存液用滤纸过滤,保存于室温棕色瓶中,可保存数周,但在使用前需要过滤。3)配制1mg/ml牛血清蛋白(BSA)做标准曲线:取样品即可测量。注意事项:1、样品制备,样品制备是做好2-d 的关键,样品中离子浓度不能过大,最好用新鲜的样品提取蛋白质,如果不确定蛋白提取情况,建议先跑sds-page检验。2、上样量的问题, ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间,上样量不合适,丰度低的将会被丰度高的所遮盖。3、ipg 胶条ph 的选择,根据不同样品选择不同pH值。4、针对不同的蛋白质,分离胶的浓度需调整。考马斯亮兰法(Bradford法)测定蛋白浓度
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