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细胞周期的流式检测方法细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程,分为G0/G1期、S期、G2/M期。在科研实践中,很多实验具有对细胞群体的周期分布进行检测的需求。细胞群体周期测定的方法有很多种,最常用的是PI(碘化丙啶)渗入DNA进行染色,然后通过流式细胞仪检测PI从而测定细胞群体的周期分布。因此,下面笔者主要通过BD(BectonDickinson)公司生产的BD FACSCalibur流式细胞仪测定PI标记的细胞群体为例,对细胞周期的流式检测方法进行阐述。一、 PI染色步骤概略1、单细胞悬液离心,1500rpm , 5min,弃上清。2、PBS 1ml离心,弃上清。3、70%酒精2ml,4,30min,离心,弃上清液。4、PBS 1ml离心,弃上清。5、RNase A的PBS溶液 (20ug/ml),500ul,37,30min,离心弃上清。6、PBS 1ml离心,弃上清。 7、PI的PBS溶液(50ug/ml),500ul,室温避光孵育30min。8、吹打混匀,300目筛网过滤至流式管中,4保存,待测。二、 Calibur仪器设置及数据收集1、 依次打开Calibur机器电源、电脑开关和CellQuest Pro软件,按快捷键Command+B连机,按快捷键Command+1、2、3、4调出Detectors/Amps面板、Threshold面板、Compensation面板和Status面板,软件的操作界面如图1所示。图1. Cell Quest Pro软件操作界面2、 建立实验模板,包括FSC/SSC散点图、FL2-W/FL2-A散点图和FL2-A直方图。因为PI在Calibur上是由488nm的激光器激发,530/30滤光片收集信号,所以选择FL2通道进行检测。细胞周期是2N和4N的循环,所以FL2通道的Mode参数应设置为Lin模式,同时阈值(Threshold)的Primary Param参数设置为FL2-H,Four Color DDM Param参数设置为FL2,如图2、图3所示。图2. Detectors/Amps面板 图3. Threshold面板3、 设置细胞的收集数目,数据保存的路径和名称,如图4、图5所示。图4. AcquisitionStorage面板图5. Acquisition面板4、在图6所示的操作面板中,勾选Setup选项,点击Acquire按钮进行数据收集并调节FL2通道的电压值使得周期图位于FL2直方图中合适的位置。调好电压后,将Setup选项勾掉,点击Acquire按钮收集数据。数据以.FCS格式保存在之前预设好的文件夹中。图6. Acquisition Control面板三、 细胞周期数据的分析流式数据分析软件有很多种,比如Cell Quest、BD FCAS Diva、FlowJo等等。但对于细胞周期数据的分析,统一的分析步骤如下:1、 建立FSC/SSC散点图,圈定细胞群,如图7所示。图7. FSC/SSC散点图2、 建立FL2-W/FL2-A散点图,去除粘连细胞,如图8所示。图8. FL2-W/FL2-A散点图3、 建立FL2-A直方图分析细胞周期,如图9所示。图9. FL2-A直方图
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