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第十一章 细胞增殖及其调控教学目的:1 掌握细胞增殖的方式及特点2 了解细胞周期调控的机理教学重点:1 有丝分裂、减数分裂2 各种调控因子的作用教学难点:细胞周期调控的机理讲授与讨论第一节 细胞周期与细胞分裂一、细胞周期(Cell cycle)(一) 概述细胞周期亦称有丝分裂周期(mitosis cycle),细胞生长到一定程度,不是繁殖就是死亡。细胞分裂后产生的新细胞生长增大,随后又平均地分裂成两个和原来母细胞“一样”的子细胞,细胞这种生长与分裂的循环称细胞周期。1细胞周期的概念 具体地说,细胞周期是指细胞从一次分裂结束开始生长,到下一次分裂终了所经历的过程。又叫细胞的一个生活周期,是一个细胞物质积累与细胞分裂的循环过程。一个周期所占用的时间,即为细胞的一个世代(generation time)。2 细胞周期的划分最早划分细胞周期的是Howard Pelc (19511953),从细胞形态的变化考虑,将细胞周期划分为间期(interphase)和分裂期(mitosis phase或division phase),间期是物质准备和积累阶段,分裂期则是细胞增殖的实施过程。间期难以靠形态学指标划分,Howard发现DNA是在间期的一定时间合成的,于是,他将间期划分为DNA合成前期(G1),DNA合成期(S)和DNA合成后期(G2)。M期依形态学指标分为前、中、后、未四个时期,各个时期又称为时相。整个周期表示为:G1SG2M。从细胞增殖的角度来看,G1期细胞可分为3类:1增殖细胞(周期中细胞、连续分裂的细胞) 有些细胞(少数),可以离开变动期进入固定期,然后进入S期,重新开始分裂增殖,它们是能继续增殖的细胞。在一群细胞中,只有一小部分细胞进入M期。进入M期细胞所占该群细胞的百分数,称有丝分裂指数(mitotic index)。2休止细胞(静止期细胞) 有些细胞通常情况下不能合成DNA,处于静止状态可达数月甚至更久,但当给予某种刺激时,可重新进入细胞周期,可见这些细胞是暂时不继续增殖,但具潜在增殖能力。1963年,Lajtha将这些休止细胞叫Go期细胞,指一种暂不增殖而又保持着分裂潜力的,在一定条件下可恢复增殖能力的细胞。认为它们是暂时退出细胞周期的细胞。如肝、肾细胞、淋巴细胞(Go期)经PHA刺激淋巴母细胞进入分裂周期。3丢失细胞(loss cell) 终端分化细胞或不育细胞、不分裂细胞。这部分细胞终生处于G1期,通过分化、衰老至死亡。如角质细胞、神经细胞、肌细胞、红血细胞等。 (二)细胞周期各时相的主要事件1 G1期 此期可再细分为变动期和固定期。所有通过M期的细胞都要进入G1期的变动期,以后便走向不同的命运。处在G1期的细胞,除丢失细胞外,不管是增殖细胞,还是Go期细胞,当它们待要进入细胞周期时,首先进行旺盛的物质合成,为进入S期作各种准备。2 S期S期长短差异,是与复制单位多少决定的。S期的活动,是由于细胞内产生了一种蛋白质性质的DNA合成诱导者。有人将S期细胞与G1期细胞融合后培养,可引起G1期细胞核DNA复制提前。3 G2期 继续为进入M期创造物质条件细胞能否顺利通过G2期进入M期,受到G2期检验点的控制,这一调控点有人称作R2。有人设想,可能与cAMP有关,也有人认为抑素在该期仍有作用。当这种细胞受适宜刺激后,无需DNA复制,可直接进入周期。4 M期(三)细胞周期的研究方法1 细胞周期各时相长短测定(1)标记有丝分裂百分数法(Percentage of labelled mitosis ,PLM法) 此法目的是测定某一细胞群体的细胞周期的总时间Tc和各个时相的时长。方法简述:给机体注入3HTdR,处于S期细胞吸收3HTdR被标记,随后G2期细胞开始出现标记细胞,接着在一短的tm时间后,出现的全是标记分裂相,并在tstm时间内保持不变,最后标记分裂相聚然消失。依标记分裂指数曲线升降过程,可推求出细胞周期各时相的时长。(2)流式细胞分选仪测定法2 细胞周期同步化法(cell synchrony) 是指将细胞群体阻留在细胞周期同一时相的方法。自然同步(natural synchrony) 在自然界中,有些生物本身有部分地或短时间的细胞分裂同步的现象。人工同步法 指用人为的方法,使培养细胞分裂同步化。(1)诱导同步法(induction synchrony),这一方法是用物理、化学方法处理培养细胞,使之停留在细胞周期的某一时相。a、DNA合成阻断法(代谢抑制法):过量TdR可将细胞阻止在G1/S交界处。b、中期阻断法(分裂抑制法)秋水仙碱M期缺异亮氨酸G1期(2)选择同步法(selection synchrony) 用人工方法,从细胞群体中选出某一发育时期的细胞。a、分裂细胞收获法: b、细胞沉降分离法:c、选择性失活法:d、膜淘洗法: 3 细胞融合法 利用不同时相细胞间的融合,可以探讨各时相的生化变化及调控。(四)特异的细胞周期卵裂之特点:1周期短,几乎只有S、M。2卵内物质重新分布而无细胞的生长。3核质比例越来越大渐近正常细胞。二、细胞分裂(cell division)(一)原核细胞的分裂原核细胞和真核细胞的细胞分裂方式有很大的不同。原核细胞的分裂方式简单,细胞周期短,在适宜条件下可大量繁殖(如细菌每20分钟就可分裂一次),其分裂方式为一分二或二分裂,习惯上又称无丝分裂或直接分裂。(二)真核细胞的分裂真核细胞的分裂较原核细胞复杂的多,根据细胞在分裂过程中所表现的形式不同,大体分为三种类型,无丝分裂,有丝分裂和减数分裂。1 无丝分裂(amitosis)又称直接分裂(direct division)因为这种分裂方式是细胞核和细胞质直接分裂。是发现最早的一种细胞分裂方式。早在1841年,R.Remak首先在鸡胚血细胞中观察到这种分裂方式。因为在分裂过程中没有出现纺缍丝和染色体的变化,所以1882年,Flemming提出无丝分裂的概念。2 有丝分裂(mitosis)最初称这种分裂方式为核分裂(karyokinesis),因为在分裂过程中出现纺缍丝和染色体等一系列变化,然后才出现细胞的真正分裂,所以又称为间接分裂(indirect division)或有丝分裂。1882年Flemming提出,还由于这种分裂方式是多细胞生物体的体细胞的分裂方式,故又称体细胞分裂。有丝分裂过程的分析有丝分裂是一连续的复杂动态过程,为叙述方便,根据形态学上的变化,按这些过程的先后顺序分为前期(前中期)、中期、后期和未期。下面以动物细胞的分裂为例,说明各期特点胞质分裂(cytokinesis)除特殊组织细胞外,多数细胞在染色体解旋和核膜形成的同时,便进行细胞体的分裂,或称胞质分裂。但也有胞质分裂与核分裂不同步的。动物细胞的胞质分裂,是以缢缩和起沟的方式进行的,缢缩的动力推测是由于在细胞质周边有一个微丝组成的“收缩环”,它的紧缩使细胞产生缢束,在缢束处起沟,使细胞一分为二。植物细胞的胞质分裂,因带有细胞壁的缘故,另具特点。是靠形成细胞板来完成的。在分裂未期,赤道面处的纺缍丝保留下来,并增加微管数量,向四周扩展,形成桶状结构成膜体(phragmoplast)。来自内质网和高尔基复合体的含有多糖的小泡移向成膜体,小泡膜融合在一起而成为细胞板(cell plate)。一些充满果胶类物质的小泡,继续向细胞板间添充,形成中胶层及初生壁成分。最后细胞板两层膜和亲体细胞的质膜融合,将细胞一分为二。3 减数分裂(meiosis)meiosis是真核细胞中一种特殊类型的细胞分裂,出现在进行有性生殖的生物的生殖细胞中,是1883年Beneden最先阐述的,指通过两个细胞周期使染色体数目减少一半的细胞分裂方式。由于发生在生殖细胞成熟过程中,所以又有成熟分裂(maturation division)之称。通过减数分裂使亲代与子代之间的染色体数目保持恒定,保证了物种的相对稳定性;另外在减数分裂过程中,发生非同源染色体的重新组合,以及同源染色体间的部分交换,从而使配子的遗传基础多样化,这就为生物的变异及其对环境条件的适应性提供了重要的物质基础。因此,减数分裂是生物有性生殖的基础,是生物遗传、生物进化和生物多样性的重要基础保证。(1)由mitosisi向meiosis的转变精原细胞和卵原细胞是进行mitosis的,为什么到了初级性母细胞就改为减数分裂了呢?是什么因素控制调节这种分裂方式的转变的呢?这些问题尚不清楚,推测可能是多因素的综合作用结果,不过根据有些学者初步实验,可以断定这种转变是发生在前减数分裂的G2期。减数分裂前间期的G2期。(2)减数分裂过程的分析第一次减数分裂或减数分裂(first meiotic division,meiosis)包括:前期、中期、后期、未期和胞质分裂六个阶段。然后,通过一个短暂的间期进入减数分裂。第二次减数分裂或减数分裂(second meiotic division,meiosis)包括:前期、中期、后期、未期)减数分裂有其鲜明特点,主要表现在前期染色体配对和基因重组。减数分裂与一般有丝分裂雷同。前期根据染色体的形态变化可划分为以下几个时期:细线期偶线期(合线期)粗线期双线期4 Meiosis的生物学意义及其与Mitosis之比较5 影响细胞分裂的因素能够影响细胞分裂的因素很多,而且极为复杂,目前还没达到对其全面认识的水平,下面仅就已取得的资料作一介绍。(1)细胞大小(2)抑素(3)cAMP (4)激素 (5)接触抑制(contact inhibition) 第二节 细胞周期的调控真核细胞周期有两个基本事件:一是S期进行染色体复制,二是M期将复制的染色体分到两个子细胞中去。在这两个基本事件前,均有一段间隙期,即G1期和G2期。在这两个间隙期,细胞进行着复杂的决定过程。在G1晚期,作为一个新周期的开始点,亦即细胞决定启动新一轮自我复制的位点(Start point或restriction Point)受到复杂精细的调控,根据发育需要,或者开始新一轮增殖,或者退出周期分化为特殊功能的细胞或暂时进入G0期,决定要进入分化状态或G0期的细胞,不能越过“Start”或“restriction”位点。而要增殖的细胞必须有生长因子的作用,命令细胞通过“start”位点,启动新一轮自我复制。因此,细胞周期存在着G1/S转换和G2/M转换两个重要的控制点。一、MPF的发现及其作用1 染色体超前凝集实验细胞促分裂因子2 非洲爪蟾卵细胞质注射实验促成熟因子(MPF)1971年,利用非洲爪蟾卵细胞质注射实验,发现在成熟的卵细胞的细胞质中,必然有一种物质可以诱导卵细胞的成熟。他们把这种活性物质称为卵细胞促成熟因子(maturation promoting factor)或细胞促分裂因子(mitosis-promoting factor)或M期促进因子(M phase-promoting factor),用 MPF表示。二、p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系裂殖酵母的cdc2基因,是第一个被分离出来的cdc基因,它的表达产物是一种相对分子量为34103的蛋白,被称为p34cdc2。进一步研究发现,p34cdc2具有蛋白激酶活性(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶),可以使多种蛋白质底物磷酸化,因而被称为p34cdc2激酶。在G1/S转换和G2/M转换两个地方都发挥作用(即阻断细胞周期在晚G1期或G2期)。芽殖酵母的cdc28基因是继cdc2基因之后第二个被分离出来的cdc基因,它的表达
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