摘 要致病菌细胞的近红外光谱法鉴别研究食品与生物工程学院 荣宗有指导教师 刘建学摘要近红外光谱检测技术是近年来发展最快的检测技术之一，具有无损、快速、高效、方便和环保的特点。本文以对数生长期的沙门氏菌、单增李斯特菌等致病菌为研究对象，考察近红外光对致病菌细胞的作用，分析致病菌细胞的近红外光谱的图谱，利用基于主成分分析技术的投影判别分析对致病菌细胞的鉴别和检测限进行了研究，得到了预期结果。1.无菌操作，采用平板划线分离培养法和纯种细菌移种技术对沙门氏菌、单增李斯特菌分离培养进行研究，结果表明，沙门氏菌、单增李斯特菌在营养琼脂培养基、含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂（TSAYE）均能生长良好。2.采用光电比浊法，对沙门氏菌的对数生长期进行研究。通过比较沙门氏菌的生长曲线图，研究其生长趋势，确定了沙门氏菌的对数生长期，最后选定16h为沙门氏菌的培养时间。3.根据不同浓度梯度的沙门氏菌、单增李斯特菌的全细胞、细胞壁和细胞质的近红外光谱图谱，利用基于主成分分析技术的投影判别分析，研究两种菌的近红外光谱鉴别方法。结果表明，不论是利用全细胞、细胞壁还是细胞质的近红外光谱分析，都可以将大肠杆菌和单增李斯特菌区分开来。关 键 词：近红外光谱，沙门氏菌，单增李斯特菌，鉴别,检测限Research on the near-infrared spectrum detection limit of Pathogenic bacteria cellsCollege of Food and Biological Engineering Rong zong-youLiu Jian-xue ProfessorABSTRACTNear-Infrared spectroscopy detection technique is one of the fast developing technology，which is nondestructive, fast, efficient, converient, and environmentally friendly. The thesis explores the action mechanisms of near-infrared spectroscopy in the detection of pathogenic bacterias, analyses the near-infrared spectral of pathogenic bacteria cells, taking Salmonella and L.monocytogenes as the research object which is in the logarithmic growth phase, using projection discriminant analysis based on PCA to identification of the pathogen bacteria cells ,as well as the examination limit for a study to get the expected result.1. Aseptic technique, Research the Growth situation of Salmonella and L.monocytogenes in both Nutrient agar culture medium and Including 0.6% yeast paste pancreas cream peptone soybean agar-agar culture medium(TSAYE). The results show that，Salmonella and L.monocytogenes are not high to the nutrition demand and Can grow well in both Nutrient agar culture medium and Including 0.6% yeast paste pancreas cream peptone soybean agar-agar culture medium(TSAYE).2. Carried out a research into logarithmic growth phase of Salmonella and L.monocytogenes, taking the use of photoelectric turbidimetry. In this study, the growth curves of Salmonella and L.monocytogenes is compared to they growth chart, from which we can see the growth trend of Salmonella and L.monocytogenes so as to determinate the Salmonella and L.monocytogenes logarithmic growth phase. At last, 16h was selected to the Salmonella culture time and 18h for the L.monocytogenes culture time.3. A study about the near-infrared on the distinction method of both pathogenic bacteria cells had been carried out, using the projection discriminant analysis which is based on principal component analysis. according to the different concentration gradient of near infrared spectra of the Salmonella and L.monocytogenes entire cell、cell wall and cytoplasmic . The results show that，KEY WORDS: Near-Infrared spectroscopy, Salmonella, L.monocytogenes, distinctionIII目 录目录第1章 绪论11.1沙门氏菌的概论11.1.1 沙门氏菌的病原学特性11.1.2 沙门氏菌的发病机理11.1.3 沙门氏菌导致的临床症状21.2 单增李斯特菌的简介21.3 有害致病菌检测技术的概述21.3.1 色谱技术31.3.2 化学比色法31.3.3 近红外光谱检测技术41.4 近红外光谱概论41.4.1 近红外光谱分析技术的原理41.4.2 近红外光谱分析技术的应用51.5 立题意义和研究内容51.5.1 立题意义61.5.2 研究的主要内容6第2章 沙门氏菌、单增李斯特菌分离培养的研究72.1 前言72.2 材料82.2.1 菌种82.2.2 试剂92.2.3培养基102.2.4试验仪器102.3 试验方法112.3.1 沙门氏菌、单增李斯特菌的活化及分离培养122.3.2 沙门氏菌、单增李斯特菌的观察计数132.4 结果与分析132.4.1 沙门氏菌的生长情况142.4.2 单增李斯特菌的生长情况152.5 小结16第3章 沙门氏菌对数生长期的研究173.1 前言173.2 材料183.2.1 菌种183.2.2 试验仪器193.3 试验方法193.3.1 沙门氏菌的活化及分离纯化203.3.2 沙门氏菌种子液的制备203.3.3 比浊法测定沙门氏菌的生长曲线213.4 结果与分析213.4.1沙门氏菌的生长曲线223.5 小结22第4章 沙门氏菌、单增李斯特菌细胞的近红外光谱研究224.1 前言224.1.1 菌种234.1.2 主要仪器234.1.3 主成分分析（PCA）方法介绍234.2 试验内容244.2.1 样品的制备244.2.2 光谱信息的采集244.3 结果与分析244.3.1 沙门氏菌、单增李斯特菌的鉴别254.3.2 小结25第5章 总结和展望265.1 总结265.2 展望26参考文献27致谢27第1章 绪论第1章 绪论1.1 沙门氏菌的概论沙门氏菌属（Sallmonall）是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科中的一个大属，它包括2000多个血清型。病原学认为，沙门氏菌是一种人畜共患和食源性疾病的致病菌。世界各地的食物中毒中，英国、中国沙门氏菌食物中毒居首位，美国居第二位1。食源性致病菌作为一个严重的公共卫生问题是影响食品安全的主要原因之一，它严重危害着人们的生命健康从而造成重大经济损失。因此，对致病性细菌的快速检测一直是相关研究的热点2。1.1.1 沙门氏菌的病原学特性(1)形态与染色沙门氏菌为革兰氏阴性，较为细长的杆菌，大小为（13m）（0.40.9m），不产生芽孢，一般无荚膜，但在黏液样变异时，可见菌体黏液层增厚。(2)培养特性沙门氏菌为需氧或兼性厌氧。生长温度为1042，最适温度为37。适宜pH为6.87.8。对营养要求不高，一般在普通培养基上均能良好生长。在培养集中若加入硫代硫酸钠、胱氨酸、血清、葡萄糖、淀粉、脑心浸液、胶体硫或甘油等，均有助于本菌的生长。普通琼脂培养基：培养24小时后，形成中等大小、圆形或近似圆形、表面光滑、无色半透明、边缘整齐的菌落。普通肉汤培养基：生长良好，均等浑浊。(3)抗原构造沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般可分为4种，即菌体抗原，又称为O抗原；鞭毛抗原，又称为H抗原；表面抗原，又称为K抗原；以及菌毛抗原。(4)抵抗力沙门氏菌对热及外界环境的抵抗力属于中等，60作用2030min即被杀死3。1.1.2 沙门氏菌的发病机理沙门氏菌引起食物中毒时，需感染大量菌才能致病。沙门氏菌随食物进入消化道以后，在小肠和结肠里繁殖，附着于肠黏膜上皮并侵入粘膜下组织，使肠黏膜发炎，从而抑制了肠黏膜对水和电解质的吸收，并引起水肿、出血等。随后在通过肠黏膜上皮细胞之间侵入粘膜固有层，在固有层内引起炎症。未被吞噬细胞杀灭的沙门氏菌，经淋巴系统进入血液，而出现一时性菌血症，引起全身感染。同时活菌在肠道或血液内崩解出毒力较强的大量的菌体内毒素，而引起全身中毒症状。1.1.3 沙门氏菌的临床症状沙门氏菌食物中毒的临床症状是由活菌和内毒素的协同作用引起的，以急性胃肠炎型为最多，潜伏期一般1224h，有时可短至68h或长至2d，开始时症状为头痛、全身乏力、发冷和恶心等，以后出现呕吐、腹痛和全身酸痛。病人发热大都在3940，重病人出现寒战、抽搐和昏迷等。病程37d，一般愈后良好。但老人、儿童和体弱者，如不及时进行急救处理，也可导致死亡，死亡率约为1%左右4。1.2 单增李斯特菌的简介单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种人畜共患病的病原菌。本菌为兼性厌氧革兰氏阳性小杆菌，营养要求不高，无芽孢，耐碱不耐酸，对环境抵抗力较强。它广