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5TBE(组份浓度:5TBE,pH 8.3;配制量:1 L):称取53.9 g Tris,27.5 g硼酸,量取20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0),置于1 L烧杯中;加入约800 ml超纯水,充分搅拌溶解;加超纯水将溶液定容至1 L;室温保存。10% 过硫酸铵(组份浓度:10% (W/V) 过硫酸铵;配制量:10 ml):称取1 g过硫酸铵,置于1050 ml烧杯中;加入约8 ml超纯水,搅拌溶解;加超纯水将溶液定容至10 ml;4 保存(保存时间为2周左右,超过期限过硫酸铵将失去催化作用)。30% 丙烯酰胺(组份浓度:30% (W/V)丙烯酰胺;配制量:1 L):称取290 g丙烯酰胺,10 g N,N-亚甲基双丙烯酰胺,置于1 L烧杯中;加入约600 ml超纯水,水浴加热至37 ,充分搅拌至溶解;加超纯水将溶液定容至1 L,用0.45 m滤膜过滤除去杂质;并检测该溶液pH值应不大于7;棕色瓶4 保存。0.1% AgNO3(组份浓度:0.1% (W/V) AgNO3;配制量:1 L):称取1 g AgNO3,置于1 L烧杯中;加入约800 ml超纯水, ;加超纯水将溶液定容至1 L;棕色瓶室温保存。显色液(组份浓度:2% (W/V) NaOH,0.04% (W/V) Na2CO3,0.4% (W/V) 37%甲醛;配制量:1 L):称取20 g NaOH,0.4 g Na2CO3,置于1 L烧杯中;加入约800 ml超纯水,充分搅拌溶解;加4 ml 37%甲醛溶液,加超纯水将溶液定容至1 L;室温保存。10% 冰乙酸(组份浓度:10% 冰乙酸;配制量:1 L):量取100 ml冰乙酸,置于1 L烧杯中;加入约800 ml超纯水,搅拌混匀;加超纯水将溶液定容至1 L;室温保存。2.2.6 电泳检测2.2.6.1 玻璃板清洗首先用去污粉将电泳用玻璃板、胶垫、梳子等反复清洗;然后用级蒸馏水漂洗23次,直至玻璃板表面出现均匀水膜,既不聚成水滴,也不成股流下;再用超纯水漂洗1次,晾干;最后用无水乙醇擦拭,晾干备用74。2.2.6.2 缓冲液贮液和凝胶母液的制备缓冲液贮液用5TBE,具体配制方法见2.1.2.2,用时稀释5倍。凝胶母液用30%丙烯酰胺,具体配制方法见2.1.2.2。2.2.6.3 聚丙烯酰胺凝胶的制备10% 非变性聚丙烯酰胺凝胶(两块,约55 ml)各组分用量如下58:30% 丙烯酰胺:18 ml5TBE:11 ml超纯水:25 mlTEMED:36 ml10% 过硫酸铵:385 ml具体操作步骤如下75:首先,按要求组装好垂直电泳板,两块玻璃板的底部用1.5% 琼脂糖封边,防止封闭不严而导致聚丙烯酰胺胶液漏出。然后,灌胶。分别量取配比用量的30% 丙烯酰胺、5TBE和超纯水置于100 ml烧杯中,用玻璃棒搅拌混匀;然后用微量加样器加入配比用量的10% 过硫酸铵和TEMED,加入后聚合即开始,迅速摇匀;立即用玻璃棒引流,将混合液灌注于两块玻璃板之间,灌胶过程一次性完成,避免产生气泡;灌胶完成后,一次性平稳插入样梳以形成点样孔。最后,待聚合完全后往电泳槽中加入1TBE缓冲液直至没过点样孔,且正负极槽内缓冲液高度应一致。聚合时间一般在3060 min左右,凝胶聚合完全的标志是点样孔附近形成清晰的界面,轻轻拔去样梳,避免破坏点样孔,并立即用电泳缓冲液冲洗点样孔,以清除点样孔中的气泡和未凝固完全的胶液。2.2.6.4 电泳取PCR扩增产物5 ml与1 ml上样缓冲液混合均匀后点入点样孔,用10% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,以20 bp DNA ladder(Takara)作为分子量标准,缓冲液为1TBE。接通电源,恒压180200 V,电泳810 h,直至溴酚蓝距离凝胶边缘约1 cm时,停止电泳。2.2.6.5 银染、显色具体步骤如下76-78:(1)卸下玻璃板,用塑料薄片撬去上面一块玻璃板,并小心除去下方的琼脂糖凝胶;然后将附有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板以凝胶面朝下浸入盛有约200 ml超纯水的玻璃器皿中,凝胶即脱落于水中,轻轻摇晃15 sec,倒掉液体;(2)加入约200 ml 0.1% AgNO3,置于摇床之上,以轻摇20 min左右,倒掉液体;(3)加入约200 ml超纯水,轻摇15 sec,倒掉液体;(4)加入约200 ml显色液,轻摇510 min,直至出现清晰带型,倒掉液体;(5)加入约200 ml超纯水,轻摇15 sec,倒掉液体;(6)加入约200 ml 10% 冰乙酸,固定;(7)用Bio-Rad紫外凝胶成像系统观察,照相以记录电泳结果。1.4.3 聚丙烯酰胺凝胶改进的银染方法(1) 电泳结束后切断电源, 从电泳槽中倒出缓冲液, 然后取下胶板, 将凝胶从玻板中取出放入装有蒸馏水的瓷盘中, 用蒸馏水漂洗2 次。(2) 银染: 加入染色液(0.2%的AgNO3、1%的冰醋酸、10%的无水乙醇)进行银染, 然后用蒸馏水漂洗2 次。20min(3) 显影: 加入显影液(3%的无水NaOH, 每200 mL 溶液加1 mL 甲醛)进行显色。8min(4) 凝胶摄影: 用数码相机对凝胶进行照相。
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