1材料和方法1.1材料1.1.1组织和细胞的来源：1.1.2仪器设备机械组织匀浆器低温高速离心机(40,000g)超速离心机超生细胞破碎仪超纯水装置1.1.3试剂三氯醋酸(TCA)丙酮二硫苏糖醇(DTT)尿素CHAPSPMSFEDTA乙醇磷酸考马斯亮蓝R350抑肽素A亮肽素试剂纯度均应是分析纯或以上。1.1.4溶液配制(1)PBS：NaCI8g,KCI0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO4，溶于800ml水中，用HCI调pH至7.4，用纯水定容至1L；EDTA储存液：18.61gNa2EDTA2H2O,溶于70ml纯水中，用10mol/LNaOH调节pH值至8.0(约需2gNaOH颗粒)，定容为100ml。可高压灭菌后分装备用；(3) 亮肽素储存液(50ug/ml,100X)10mg/ml溶于水，-75C保存；使用时配成50ug/ml储液，-20C保存；(4) 抑肽素储存液(70ug/ml,100X)1mg/ml溶于甲醇，-75C保存；使用时配成70ug/ml储液，-20C保存;PMSF储存液(10mM,100X):17.4mgPMSF，溶于1ml异丙醇中，-20C保存。DTT储存液(1M):0.31gDTT溶于2mlH2O中，-20C保存(DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。(7)裂解液：LysisbufferA(9Murea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)LysisbufferB(7Murea,2Mthiourea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)LysisbufferC40mMTris-base(pH9.5)inultrapureH2OLysisbufferD(8Murea,4%CHAPS,40mMTris(base),40ml)LysisbufferE(5Murea,2Mthiourea,2%SB3-10,2%CHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)LysisbufferF100pLSDSsamplesolution(1%w/vSDS,0.375MTris-HCl,pH&8,50mMDTT,25%v/vglycerol)CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。蛋白酶抑制剂混合物3成分终浓度蛋白酶抑制剂混合物PMSF35ug/mlor1mMEDTA0.3mg/ml(1mM)抑肽素0.7ug/ml亮肽素0.5ug/ml1.2方法1.1.1组织蛋白提取方法1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法1(1) 冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步；(2) 在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织；(3) 将粉末悬浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸(w/v)的丙酮溶液中；(4) 蛋白-20C沉淀过夜；(5) 35000Xg(6C)离心30min；将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中；(7)-20C放置1h；35000Xg(6C)离心30min；(9) 在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀；(10) 在裂解液中重新溶解沉淀(50-100mg组织需要1ml裂解液)；(11) 15C,40000Xg，离心1hr；(12) 用Bradford法2测定上清的蛋白浓度，分装后置-75C保存。1.2.1.2超速离心法(1) 取材；(2) 用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30s；(3) 组织悬液15C,10000xg离心10min；(4) 上清液4C,150000Xg超速离心45min；(5) 小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6C40,000g再次离心50min；取离心上清。Bradford法定量，分装后置-75C保存。1.2.2培养细胞蛋白提取1.2.2.1循环冻融法吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次；(2) 加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中；(3) 500Xg，离心5min；(4) 弃上清，PBS洗三次(室温,500Xg,5min)，(5) 在离心管中加入1mlPBS,重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中；执行Biofuge存储程序8,500Xg5min离心；用200ul微量加液器吸出PBS，弃去；吸干残留的PBS,估计样品体积，加入5倍体积裂解液，巴氏滴管混匀，液氮中反复冻融三次(每次置液氮中3s，室温融化)，DTT在第一次冻融后加入；(9) 执行Biofuge存储程序6,15C,40000Xg,离心1hr(Biofuge)；(10) 上清Bradford法定量，沉淀-75C保存备用。1.2.2.2超声破碎法(1) 取对数生长期的细胞，吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次；(2) 加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中；(3) 室温，500Xg,离心5min；(4) 弃上清,PBS洗3次(室温,500Xg,5min)；(5) 在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中，500Xg离心5min；吸干残留的PBS,估计样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴中以最大功率超声破碎细胞(3X10S)；(7)15C,40000Xg，离心1hr(Biofuge)；上清Bradford法定量，沉淀-75C保存备用。2结果和讨论蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清。我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法；破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。循环冻融法操作简便，比较适合提取培养细胞的稳定蛋白，我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性，同时要注意散热。匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法，我们实验室在破碎脑和脊髓组织时常用此法；由于神经组织比较柔软，液氮研磨法也很适合，本实验中我们使用了这一方法破碎大鼠脊髓组织，中枢神经组织由于富含脂类，沉淀法和高速离心法可以使蛋白和脂类干扰物质有效分离，但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严重。高速离心的缺点是需要样品量大，如BeckmanL7-65超速离心机的离心管容量为8ml,不适用小量样品的制备。在众多的裂解液配方中，我们主要采用9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物，原因是这一配方经长期使用很稳定，裂解效率也较高，非常适合小量细胞蛋白提取要求。针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用，高浓度的尿素可以造成强变性条件(但如果再提高尿素浓度，尿素就容易析出，影响蛋白的溶解),过量的去污剂也可以减少脂类的污染，两性电解质可以提高蛋白的溶解度，同时有利于等待聚焦。早期我们加入Tris碱以防止蛋白的水解，但是由于盐离子的引入，导致IEF电压过低，影响聚焦。