四君子汤对烟曲霉菌体外生长的抑制作用 作者：余克花 王鹏刘金辉 谢小梅，汪雁 【摘要】 目的探讨中药方剂四君子汤是否可以抑制体外培养的烟曲霉菌的生长。方法一定剂量的四君子汤和氟康唑处理的103个烟曲霉菌孢子涂布在沙氏固体培养基培养4 d，计算并比较烟曲霉菌生长形成的菌落数量、菌落大小、镜下计数孢子柄与孢子的数量。结果与对照组相比，四君子汤和氟康唑可以显著降低烟曲霉菌的菌落数量和菌落大小、抑制孢子柄与孢子的的形成(P 【关键词】 四君子汤;烟曲霉菌;分生孢子 Abstract：ObjectiveTo explore the inhibitory effect of Si-jun-zi decoction on growth of Aspergillus fujmigatus in conidia of Aspergillus fumigatus treated with different concentrations of Si-jun-zi decoction and Fluconazole were plated on the Sabouraud dextrose agar and cultivated for 4 number and size of colony were measured. The number of conidia and conidiophore were counted under with control group,Si-jun-zi decoction and fluconazole could decrease colony number and size significantly and inhibit the formation of conidia and conidiophore(P Key words：Si-jun-zi decoction;Aspergillus fumigatus;Conidium 烟曲霉菌是导致免疫低下患者肺部感染，侵袭性肺曲霉病(Invasive Pulmonary Aspergillosis, IPA)的常见真菌。IPA死亡率高达80%90%，预后很差1。四君子汤作为传统的中药补益方剂，能明显改善机体免疫功能2。动物实验研究发现四君子汤通过提高机体免疫功能，治疗烟曲霉菌感染导致的IPA 具有一定的效果3。四君子汤对烟曲霉菌生长的直接抑制作用作为治疗IPA的一种机制还未见报道。本研究将一定剂量的四君子汤处理的烟曲霉菌孢子涂布在沙氏固体培养基进行培养，通过计算烟曲霉菌生长形成的菌落数量及测量菌落大小、镜下计数分生孢子柄与分生孢子的数量，以分析四君子汤是否可以抑制烟曲霉菌的体外生长，为将中药补益方剂用于治疗难治性的IPA病积累实验数据。 1材料 沙氏固体培养基16 g葡萄糖，蛋白胨， g琼脂，加蒸馏水至400 ml，高压灭菌后，无菌条件下倒平板，制成沙氏固体培养基4冰箱保存。 菌株烟曲霉菌临床分离株，分离号：3910，购自中国医学真菌保藏中心(南京)。 药物四君子汤：购自江西省中医院,按传统组方配制，党参9 g，白术9 g，茯苓9 g，甘草6 g。称取中药饮片33 g置砂锅中，加适量水浸泡1 h加热至沸，改用文火煎煮30 min,趁热滤过制成原液，得每10 ml相当于原药材1 g的中药水煎剂溶液。分装，高压灭菌，-20保存备用。氟康唑：FLUCONAZOLE(C13H12F1N6O，)，购自SIGMA-RBI公司，用无菌蒸馏水配成1 280g/ml。 2方法 烟曲霉菌孢子的制备将烟曲霉菌的孢子均匀涂布在沙氏固体培养基表面，37培养4 d，加入适量的%吐温生理盐水于培养皿，轻轻晃动，使孢子游离于吐温生理盐水中，吸取含孢子的吐温生理盐水，经8层尼龙网过滤收集，3 000 r/min离心2 min，生理盐水洗2次，3 000r/min离心2 min，生理盐水重悬，制备成107的孢子/ml悬液。 四君子汤处理烟曲霉菌孢子取EP管编号，将沙氏营养液，四君子汤或氟康唑按照表1混匀，每管加入103个烟曲霉菌孢子，37150 r/min振荡培养1 h。 均匀涂布在沙氏固体培养基表面，37培养4 d。表1不同剂量的四君子汤处理烟曲霉菌孢子四君子汤对烟曲霉菌菌落的影响药物作用后的烟曲霉菌孢子涂布于沙氏固体培养基，每组共5块平皿，培养4 d后，直接计算菌落数，每个平皿测量20个菌落直径。 四君子汤对烟曲霉菌孢子数的影响药物作用后的烟曲霉菌孢子沙氏固体培养基培养4 d后，按方法“”收获孢子，用细胞计数板进行计数。 四君子汤对烟曲霉菌孢子柄形成的影响药物作用后的烟曲霉菌孢子经沙氏固体培养基培养4 d后，每组挑取10个典型菌落分别压片，每个菌落在光学显微镜下观察并计数连续5个视野(40)中孢子柄数的总和。计算10个菌落孢子柄的均数/5个视野。 统计学处理采用软件分析。数据用s表示, t检验法对组间均数进行差异显著性分析，P 3结果 四君子汤对烟曲霉菌菌落的影响菌落计数和菌落的直径测量结果显示，和对照组相比，四君子汤和氟康唑均可以显著抑制烟曲霉菌的体外生长(P 四君子汤对烟曲霉菌孢子数的影响不同组分生孢子收获后计数，结果显示四君子汤与氟康唑对烟曲霉菌分生孢子的生成具有一定抑制作用，其数量均低于对照组，四君子汤的抑制效果显示出剂量-效应关系。见表 3。表3四君子汤对烟曲霉菌分生孢子柄和分生孢子数的影响 四君子汤对烟曲霉菌孢子柄形成的影响菌落压片在光学显微镜下可见清晰的分生孢子柄(图1)。光镜下计数孢子柄的结果显示，氟康唑和四君子汤处理300 l四君子汤处理组孢子柄计数显著低于氟康唑处理组组的孢子柄数均显著低于对照组(P 4讨论 烟曲霉是一种多细胞条件致病真菌，正常生长繁殖过程中，其分生孢子在适宜培养基上培养一定时间后，孢子萌发产生一短的芽管, 芽管以顶端生长方式延长并产生分枝，期间细胞核分裂，核迁移至延长的菌丝内，每隔一定间距形成一横隔，将菌丝分隔成一个个小室。分生孢子柄则从特化了的厚壁而膨大的菌丝细胞垂直生出，其顶部膨大为可孕性的顶囊, 顶囊表面产生小梗，单核的分生孢子自小梗顶端以向基式生成法的方式产生46 。分生孢子从萌芽到成熟发育和再生成的过程受到早期和晚期数百个基因的调节，促使其在时间和空间上的成熟发育57。 临床治疗烟曲霉感染的药物主要是化学合成类药物，如两性霉素B、唑类化合物和烯丙胺类等，它们可直接杀灭或抑制烟曲霉生长，这些药物的毒副作用大、易产生耐药性及价格昂贵限制了其临床应用8。从20世纪20年代开始, 人们便开始从天然产物中寻找抗真菌药物9，至今已发现多种具有抗烟曲霉菌活性中药10,11。 本研究发现作为补益方剂四君子汤可以对烟曲霉菌的体外繁殖产生一定的抑制作用。用不同浓度的四君子汤预先处理的分生孢子，涂布于培养基培养4 d后的菌落计数、菌落直径、孢子柄和孢子的数量显著低于对照组(P 本研究发现100，200，300 l四君子汤处理组的菌落直径和孢子柄计数显著低于氟康唑处理组，300 l四君子汤处理组孢子数也低于氟康唑处理组，导致这种现象的机制比较复杂，可能原因是两种药物的药效成分与作用机制不同。研究表明烟曲霉的生命周期分为两个时期：菌丝发育的营养生长期和产生分生孢子的无性繁殖期，其发育和形态的改变涉及时间和空间上的基因调节。据认为干扰早期调节基因的功能会抑制分生孢子柄和分生孢子的生成6。我们认为四君子汤中的小分子主要参与孢子萌芽有关的早期基因调节，抑制菌丝的萌芽与生成，使得分生孢子柄的数量相对减少，所以导致真菌的菌落较小，最终导致分生孢子数的降低。 氟康唑比较明确的抗真菌机制是通过抑制细胞膜上的14 a去甲基化酶，从而阻断麦角甾醇的合成，破坏细胞膜的完整性而抑制真菌的生长8。但通过干扰烟曲霉菌繁殖相关基因的表达调节而抑制真菌的生长还未见报道，萌芽阶段未被完全抑制的真菌能有效的生成菌丝，生成孢子柄，使得菌落较大。 孢子萌芽是烟曲霉菌繁殖周期的早期启动时期，也是烟曲霉菌分生孢子侵入肺组织致IPA的第一步及关键基本步骤。本研究所取得的结果提示，四君子汤治疗烟曲霉菌所致的IPA具有一定的应用价值2，3。1 / 1