链霉菌室实验操作手册（2003年）第一章 培养基 抗生素 生长因子3常用抗生素及其使用浓度3LB（Luria-Bertani）培养基3LA3基本培养基（MM）3R5（1L）链霉菌原生质体转化时用4YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌）4TSBY （1L）（液体培养链霉菌）4MS培养基52CMY培养基（用于井岗的接合转移）5YMS培养基（阿维，井岗产孢）5YD培养基5生长因子补充物的使用浓度5第二章 DNA基本操作7大肠杆菌质粒的抽提7酶连反应7DNA片段凝胶回收7DNA纯化9E.coil总DNA的提取9链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进）10去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明）10AT克隆（详见说明书）10Southern Blot11第三章 PCR及相关技术13PCR13PCR重组（详见PCR技术实验指南p429 重叠延伸技术）14PCR定点诱变（DpnI法）14第四章 基因片段转移技术15大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化15DNA转化15大肠杆菌质粒的快速检测15接合转移（详见英文手册249页）16链霉菌原生质体的制备16链霉菌原生质体的转化17PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化17第五章 RNA操作技术19链霉菌总RNA的抽提19链霉菌的RT-PCR（promega RT kit）19第六章 蛋白质基本操作技术21SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色21大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）：21链霉菌总蛋白抽提：22大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系）：22Western Blot23第七章 遗传作图相关技术25链霉菌孢子悬液的制备25链霉菌中NF的证明25孢子杂交25在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因25第八章 其他技术27链霉菌菌种保藏27检测链霉菌淀粉酶的活性27第一章 培养基 抗生素 生长因子常用抗生素及其使用浓度 抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度（g/ml）链霉菌大肠杆菌MM2CMYEMELA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin, Amp Chloramphenicol, CmlHygromycin, HygKanamycin, KmSpectinomycin, SpcStreptomycin, StrThiostrepton, ThioErythomycin, EryApramycin, Amblacathygaac或aphaadAstrtsrermEaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?5010510010R255050251050R502.55050-1002550505025不敏感2030-50* 表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！*R表示不敏感*Km 和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, VioLB（Luria-Bertani）培养基胰蛋白胨 10g，酵母抽提物 5g，NaCl 5g，葡萄糖 1g，蒸馏水加至 1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺 0.5g，K2HPO4 0.5g,MgSO47H2O 0.2g,FeSO47H2O 0.01g, 蒸馏水至 1000ml 将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。配置MM的琼脂有lab agar、Ice agar(IA)R5（1L）链霉菌原生质体转化时用 蔗糖 103g K2SO4 0.25g MgCl26H2O 10.12g 葡萄糖 10g Difco酪蛋白氨基酸 0.1g 微量元素溶液 2ml Oxoid酵母提取物 5g TES 5.73g 加蒸馏水至 1000ml称取5.5g Difco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。使用时，将培养基融化，每瓶中加入： KH2PO4(0.5%) 2.5ml CaCl22H2O(5M) 1ml L-脯氨酸(20%) 3.75ml NaOH(1M)调pH至7.3 对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考手册）YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌） Oxoid酵母提取物 3g Oxoid蛋白胨Tryptone 5g 麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630） 3g 葡萄糖 10g 蔗糖 340g 蒸馏水 至1000ml高压灭菌后加入：（8磅灭菌，113114C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。） MgCl26H2O(2.5M) 2ml/L制备原生质体时，还要加入： 甘氨酸（20%） 25ml/L 蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。 甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。TSBY （1L）（液体培养链霉菌） Oxoid胰胨豆汤粉（TSB） 30g 蔗糖 340g Oxoid酵母抽提物 5g 蒸馏水 至1000ml*不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖，蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。MS培养基将黄豆饼粉加蒸馏水煮2到3小时，用纱布过滤得到滤液，将每250ml滤液分装到装有5g琼脂，5g 甘露醇的500ml三角瓶中，10磅灭菌，使用时调pH7.2-7.3。2CMY培养基（用于井岗的接合转移）可溶性淀粉 10g 胰蛋白胨 2gNaCl 1g(NH4 )2SO4 2gK2 HPO4 1gCaCO3 2g无机盐溶液* 1 ml琼脂 20g蒸镏水 1000 mlPH7.2无机盐溶液(每升)FeSO4 .7H2 O 1gMgCl.6 H2 O 1gZnSO4. 7H2 O 1gYMS培养基（阿维，井岗产孢）酵母抽提物 4g可溶性淀粉 4g麦芽糖 10gCoCl. .6 H2 O 5mg琼脂 20g蒸镏水 1000 mlPH7.2YD培养基酵母抽提物 4g麦芽糖 10g葡萄糖 4gMgCl 2gCaCl 1.5g琼脂 15g蒸镏水 1000 mlPH7.2生长因子补充物的使用浓度 天蓝色链霉菌1258 、J1501等都是营养缺陷型菌株，培养这些菌株时一般需向培养基中补加营养因子，使用浓度如表生长因子补充物的使用浓度表化合物储存液（mg/ml）1终作用浓度（g/ml）组氨酸（Histidine）1050其它氨基酸27.537腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，尿嘧啶1.57.5维生素0.10.51. 储存液用无菌去离子水配置，8磅灭菌后4oC保存。2. 对于半胱氨酸营养缺陷型菌株，补充光氨酸。第二章 DNA基本操作大肠杆菌质粒的抽提苯酚/氯仿溶液抽提法1. 接种5ml LB，37摇床过夜培养（12小时）2. 离心，3000rpm，5min去上清3. 振荡混匀沉淀，分装在2个离心管中，spin一下，吸去上清，加入150l的溶液I （50mmol/L葡萄糖, 25mmol