间充质干细胞衰老影响因素与相关信号通路关键词：间充质干细胞; 衰老; 延缓; 氧化应激;间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我更新、多向分化能力和低免疫原性，可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞和骨髓基质细胞等1，不仅存在于骨髓，还分布在脂肪，脐带和牙体等组织2。MSCs相对容易获取、分离和增殖，能够较为迅速地达到治疗所需用量;同时，可以调节免疫功能，修复损伤组织，发挥抗纤维化等作用，使其成为细胞治疗领域令人瞩目的供体细胞来源3。目前自体或异体MSCs临床试验项目已经获得美国国家食品药物监督管理局批准。然而MSCs作为理想供体细胞的同时，也有越来越多的研究发现其对医学治疗的局限性。其中，细胞衰老是制约MSCs在再生和组织工程中大规模体外扩增应用的主要因素之一。1、 间充质干细胞衰老的特征细胞衰老是细胞对各种各样的应激源作出应答后的一种细胞状态，应激源包括基因毒性因子，营养元素缺乏，缺氧，线粒体功能障碍和致癌基因激活等4。研究表明，衰老会影响MSCs的功能，包括增殖能力、克隆形成能力、分化潜能、免疫特性、端粒酶活性、细胞迁移能力和粘附性等5，突出体现在细胞增殖能力和分化潜能的衰减6。文献表明，衰老后MSCs表面特异性标志物CD44、CD90、CD105和Stro-1等表达有所降低7;细胞形态逐渐扁平肥大，胞膜成分改变，如膜内在蛋白caveolin-1含量上调;胞质pH改变，颗粒固缩;溶酶体间隔增大且活性增加，β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)产量升高;溶酶体内脂褐质累积，细胞自体荧光水平上升8;线粒体较大但功能异常，导致过量的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)产生;同时因核纤层蛋白B1的缺失，胞核完整性遭到破坏，胞质内出现染色质碎片，端粒酶明显缩短10等。总之，衰老MSCs最终的结局是停止增殖。2、 MSCs衰老影响因素2.1 、氧化应激2.1.1 、DNA损伤自由基衰老理论最早提出于1956年，该理论认为衰老是自由基(主要为ROS)对细胞造成不利影响而产生的结果10，当机体产生的自由基与抗氧化物的含量失调时的状态被称为氧化应激。随着供体年龄增长或MSCs传代次数增加，机体ROS的不断累积将导致氧化应激的产生。DNA易受到氧或氮氧活性物的氧化损伤，致使DNA甲基化与去甲基化的平衡失调从而导致相关基因的表达抑制或沉默11。2.1.2 、热休克蛋白蛋白质是ROS信号传导过程中的主要靶标，前者结构被进行可逆或不可逆的修饰，导致细胞生长、分化停滞和死亡。氧化应激反应中有两个比较关键的蛋白参与调控MSCs衰老过程，分别是抗应激性热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)和核因子红细胞2-相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)。HSPs是一种广泛存在于生物体内的保守蛋白，当生物体遭受外界不良刺激时，可发挥分子伴侣的作用。在细胞衰老的过程中，其可保护细胞免受蛋白毒性、细胞凋亡和蛋白质聚集等损害。当ROS诱导相关蛋白质发生错误折叠时，细胞内如Hsp70和Hsp90将作为伴侣蛋白分子，帮助受损蛋白质正确折叠形成特定的功能性结构12;或是在HSPs的帮助下与泛素连接酶E3结合，发生多聚泛素化后陆续降解;抑或是HSPs通过与受损蛋白结合，将其转运至胞内溶酶体而产生伴侣蛋白介导的自噬作用13。热休克蛋白转录因子1(heat shock transcription factor-1,HSF1)在衰老细胞中表达降低，从而逐渐丧失合成HSPs的能力14，当机体HSPs表达降低时，许多发生错误折叠的蛋白质无法被识别，导致蛋白质异常聚集而影响其功能发挥。同时，HSPs在维持MSCs干性方面发挥着重要作用，其低表达将使细胞的增殖和分化能力减弱7。2.1.3、 核因子红细胞2-相关因子2NRF2是氧化应激反应中主要调节因子和转录因子，激活多种抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)依赖基因。NRF2已被证明能在氧化损伤条件下严格控制MSCs的存活15。一方面，NRF2可以通过上调参与谷胱甘肽和硫氧还蛋白合成的酶的表达，发挥抗氧化作用而抑制ROS过量产生;另一方面，NRF2相关抗氧化通路也可以减少过量ROS对细胞的损害作用。NRF2/ARE途径是细胞抵御氧化应激损害最为关键的途径之一。基础状态下，NRF2被Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1,Keap1)复合体泛素化，随后被蛋白酶降解。当细胞出现氧化应激反应时，NRF2从Keap1中分离并易位至细胞核，与ARE相互作用，介导相关目的基因转录16，强化细胞抵抗ROS毒性的能力。NRF2活性在细胞衰老过程中逐渐下降，MSCs寿命可因其再激活而诱导延长17。2.1.4、线粒体DNA突变粒体基质含多组线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)，虽然mt DNA的复制与细胞周期进程无关，但氧化产物的积累会导致mt NDA突变，引发线粒体氧化磷酸化功能障碍，最终导致胞核中参与维持线粒体正常功能的基因突变以及人类线粒体相关疾病的发生18。2.2 、端粒酶的作用研究证明，染色体端粒的缩短和构型改变伴随着体内细胞可复制性衰老的进程19。Baxter等20认为，成年人细胞端粒每年以17 bp缩短，当h MSCs的端粒长度达到10 kb时，细胞将停止分裂。而端粒酶缩短触发细胞衰老的过程可能与端粒重复结合因子2(telomeric repeat-binding factor 2,TRF2)的缺失有关，导致DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)相关蛋白被激活和募集。TRF2作为一种功能蛋白，通过识别特定的多肽序列维持端粒酶的稳定性。Wu等21选择性地敲除小鼠3 端外结合蛋白Pot1a，最终导致端粒酶区域的相应DDR并且诱发衰老。简单来说，当某些端粒的长度迅速缩减，细胞将进入生长停滞状态，此时通常触发DNA损伤和影响细胞衰老状态22。3 、MSCs衰老相关信号通路3.1 、核因子κB核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是转录因子家族的一员，不仅在细胞生长、增殖和生存方面发挥重要作用，其相关信号通路也参与调节ROS水平。不断增加的ROS在激活NF-κB信号通路的同时，NF-κB下游靶基因通过增加抗氧化蛋白的合成，如锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)、铁蛋白重链、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)-1和金属硫蛋白3等，降低ROS水平，延缓衰老23。3.2 、沉默信息调节因子1干细胞的代谢作用可以影响ROS水平，同时ROS也可以通过与多种蛋白质相互作用，例如激酶、磷酸酶或转录因子等影响代谢途径，从而调控细胞周期、控制细胞的分化及凋亡等24。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是Sirtuins家族(类组蛋白去乙酰化酶)成员之一，作为一种转录调节因子参与并控制代谢信号的转录因子去乙酰化作用来调节其活性。SIRT1可以通过去乙酰化作用调控HSF125，减轻ROS造成的细胞伤害。在H2O2诱导人脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)衰老中发现，SIRT1可以与衰老细胞中高表达的p53结合，通过去乙酰化和泛素化作用对其进行降解，抑制p53水平，减轻氧化应激对细胞衰老的影响26。3.3、 脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶通路研究发现，低氧时人牙髓干细胞氧化应激相关磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(protein kinase B,AKT)通路的关键蛋白表达升高;加入抑制剂LY294002后胞内ROS释放和凋亡细胞的比例明显增加，GPX表达降低，细胞增殖能力减弱;激活的PI3K/AKT逆向调节下游蛋白叉头转录因子1(forkhead box O1,FOXO1)和caspase3表达来影响细胞内ROS产生，证明低氧条件下PI3K/AKT途径的激活可以有效抑制ROS的产生，从而调节细胞氧化应激状态27。Nan等28发现，髓核来源的间充质干细胞在H2O2诱导的氧化应激状态下，细胞增殖速率降低，凋亡增加，PI3K和磷酸化AKT蛋白表达明显降低。在相似实验条件下，大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)胞内ROS含量和凋亡细胞数量明显增高，FoxO1、FoxO3和FoxO4基因表达下降;而抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)预处理后发现，NAC可激活PI3K/AKT信号通路抑制胞内ROS的产生，上调FoxO1、FoxO3和FoxO4基因表达，保护BMSCs免受氧化应激的损害29。3.4 、p53基因p53是人体抑癌基因，研究证明p53也参与调节细胞衰老进程30。其中p53-p21-p16相关信号通路激活可加速细胞周期阻滞。但也有研究认为，p53激活在增加ROS的同时也促进了许多抗氧化基因的表达，发挥促进和抑制细胞衰老的双重作用31，猜测p53可能通过不同途径控制细胞生长和代谢，包括调节ROS水平和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)活性。m TOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调节细胞生长、蛋白质合成等，并且与特定类型的衰老诱导密切相关32。p53下调m TOR水平，且p53通路合成蛋白来预防并修复氧化应激所致的DNA损伤33，减缓细胞衰老。3.5、 p38/丝裂原活化蛋白激酶通路ROS增高，p38/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路被激活。Jim等34发现，番茄红素可提高H2O2诱导的衰老hMSCs的生存能力，降低ROS水平;胞内p38 MAPK表达上调，同时Mn SOD浓度增加，提示番茄红素通过p38 MAPK和PI3K/AKT信号通路共同调节ROS水平。Jin等35发现衰老的人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)，衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)的主要成分单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)浓度升高，通过其同源受体趋化因子受体2增加ROS的浓度，在激活p38 MAPK-p53/p21通路后，正反馈进一步提高MCP-1的分泌，加速细胞衰老进程。4 、延缓MSCs衰老的相关