不同胚龄昆明小鼠胚胎获取胚胎干细胞体外培养的比较作者：秦书俭，张海锋，单伟【摘要】 目的 探讨分离培养昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的最佳胚龄。方法 分别从孕3.5d和4.5d的母鼠子宫中分离收集桑椹胚和囊胚，比较体外培养时胚胎的贴壁率、内细胞团(inner cell mass, ICM)形成率、形成ES细胞克隆率(P1)和形成ES细胞亚克隆率(P2)。结果 孕3.5d采集的胚胎多为桑椹胚，孕4.5d采集的胚胎多为囊胚，分离培养结果表明，后者的胚胎贴壁率、ICM形成率和ES细胞克隆形成率均高于前者，均有显著性差异(P<0.05)。结论 囊胚较桑葚胚更适合作为体外分离培养昆明小鼠ES细胞的材料。 【关键词】 昆明小鼠;胚胎干细胞;胚龄胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES细胞)是从早期胚胎内细胞团(inner cell mass, ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)分离出来的能在体外长久培养的、具有多向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。ES细胞的用途很广，涉及医学和生物工程的许多领域。1981年，EVANS1和MARTIN2首次成功分离得到小鼠ES细胞。目前实验中常用的小鼠ES细胞系绝大多数来自129品系，但129品系小鼠易感染多种疾病，具高频自发畸胎瘤，因此该品系小鼠不宜用于免疫学和细胞、组织移植等研究3。昆明小鼠是一种国产远交系小鼠，其基因型与人类近似，建立昆明小鼠的ES细胞系有利于其转基因动物的获得，能够更好服务于我国的科研工作。目前虽有关于昆明小鼠ES细胞的一些研究，但对于何时收集胚胎尚未有明确报道。本实验旨在研究胚龄对分离培养昆明小鼠ES细胞的影响。1 材料与方法1.1 实验动物 选取8周龄昆明品系雄性小鼠21只;周龄为78周、体重为30g的雌性小鼠20只，用于分离培养鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF);周龄为4周、体重为2426g的雌性小鼠55只，用于分离培养ES细胞。实验动物由辽宁医学院实验动物中心提供动物质量合格证号：SYXK(辽)20030011。1.2 主要试剂与仪器 LDMEM培养基(Gibco公司，批号1459071);HDMEM培养基(Sigma公司，批号055k8311);胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所，批号AB3101C091);丝裂霉素C(浙江海正，批号050912);白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor, LIF)(Sigma公司，批号064K1083);NBTBCIP染色试剂盒(华美公司，批号NBS206006);CO2培养箱(美国SIM公司，E191TC);倒置显微镜(日本Olympus公司，CKX41)。1.3 实验方法1.3.1 MEF的分离培养及饲养层的制备 雌雄鼠合笼，每天早上观察阴道栓，见栓当天上午定为怀孕的第0.5天(days post coitum, dpc);取孕12.514.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下取出胎鼠，去除头部、尾部、内脏和四肢，用无菌眼科剪将躯干部剪成1mm3以下的碎块，用滤网过滤细胞法4分离培养MEF，并制备MEF饲养单层。1.3.2 胚胎的收集与培养 分别取孕3.5、4.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下取出子宫;用1mL无菌注射器吸入冲胚液，从子宫角端进针，保证针头进入子宫腔内，将冲胚液快速推入子宫腔;每侧子宫注入冲胚液0.20.5mL，冲胚液会将胚胎冲出;将盛有胚胎和冲胚液的平皿置于40100倍的倒置显微镜下;用移液器(上海大龙公司，0.210L，YR23777)收集胚胎;以文献5所示方法进行培养。1.4 主要观察指标1.4.1 生物学特性观察 每日于显微镜下观察并记录胚胎的生长情况(包括形态、贴壁情况、ICM形成情况等)。1.4.2 碱性磷酸酶(AKP)检测 胚胎经40g/L多聚甲醛固定0.52h;PBS洗涤3次;用TSM(0.1mol/L Tris, 0.1mol/L NaCl, 0.01mol/L MgCl2, pH 8.0)平衡，重复3次;再用TSM(0.1mol/L Tris, 0.1mol/L NaCl, 0.05mol/L MgCl2, pH 9.5)平衡，重复3次;加入NBT(350g/mL)/BCIP(180g/mL)，37避光反应30min;三蒸水洗涤3次，显微镜下观察。1.5 统计学分析 用SPSS11.5软件对实验所得数据采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 不同胚龄胚胎的生物学特征 本实验共收集3.5dpc昆明小鼠胚胎91枚，4.5dpc昆明小鼠胚胎69枚，3.5dpc昆明小鼠胚胎多为桑椹胚(图1)，周围有透明带包绕;4.5dpc昆明小鼠胚胎多为囊胚(图2)，囊腔明显，滋养层被囊腔推到一侧，有些形成ICM。胚胎AKP检测强阳性(图3)。培养的 ES细胞克隆，克隆内细胞界限不清楚，边缘清楚(图4)。2.2 不同胚龄胚胎体外培养情况的比较 囊胚胚胎的贴壁率、ICM形成率、ES细胞克隆率(P1)形成率和ES细胞亚克隆率(P2)形成率明显高于桑葚胚，两者比较均有显著性差异(P<0.05，表1表3)。表1 3.5dpc胚胎体外培养生长情况表2 4.5dpc胚胎体外培养生长情况表3 3.5dpc胚胎和4.5dpc胚胎体外培养生长情况的比较3 讨 论小鼠ES细胞的体外分离培养是一项复杂的工作，受多种因素的影响，选择恰当的时间来收集胚胎以分离胚胎细胞，对以后ES细胞的分离培养是一个极重要的影响因素。因此，在进行小鼠ES细胞研究中，胚龄至关重要。为了进行ES细胞的培养，收集胚胎的时间必须在胚胎着床以前，同时也需要胚胎在体内有一定的发育，以使胚胎更好适应体外培养环境，实验中多选孕3.54.5d来收集胚胎。EISTTER6采用培养小鼠桑椹胚单个卵裂球建成ES细胞系，其成功率比用囊胚要高的多，可能由于桑椹胚处于比囊胚更早的发育阶段，有更多的细胞保持发育的全能性，而且他采用的是桑椹胚单个卵裂球，去除了滋养层的分化诱导作用，因此ES细胞建系成功率高。WELLS7用小鼠延迟囊胚建成ES细胞系，其建系成功率达47.7%，但建成的干细胞系是否容易分化，却未报道。对于昆明小鼠来说，由于其种属特异性，在体外进行分离培养并传代的ES细胞成功率一直比较低。本实验中培养的昆明小鼠胚胎，3.5dpc胚胎75%为桑椹胚，4.5dpc胚胎100%为囊胚，与李卫东8的实验近似。胚胎贴壁率4.5dpc胚胎显著高于3.5dpc胚胎(P<0.05)，这与董晓9的研究略有不同，原因可能是培养皿中铺设的明胶对于囊胚的贴附作用强于桑椹胚，或者是处于胚胎发育后期的囊胚表面可能形成一些贴附因子，从而造成囊胚的贴壁率明显强于桑椹胚。ICM形成率4.5dpc胚胎显著高于3.5dpc胚胎(P<0.05)，表明孕期越晚，采集的胚胎越容易形成ICM，但胚龄超过4.5d的胚胎可能已经在子宫着床，不能再被冲出。ES细胞克隆形成情况4.5dpc胚胎显著好于3.5dpc胚胎(P<0.05)。说明昆明小鼠囊胚的贴壁率、ICM出现率、传代情况均显著好于桑椹胚，原因可能是因为囊胚处于胚胎发育较晚时期，对体外培养系统的适应能力较强;而桑椹胚胚胎发育小，实验中采用的体外培养系统可能不完全适宜于桑椹胚发育，培养后容易退化。胚龄越大，ICM进一步增殖和扩大，贴壁后，有足够数量的ICM细胞发育形成ES细胞株，因此，ES细胞株出现的机率就越大、数量就越多，分离时表现出细胞黏性强，不致由于吹打而过于分散，从而成功传代率就越高，但同时可能出现ICM细胞易分化的现象，可能是因为饲养层细胞的诱导或者饲养细胞分化抑制因子分泌不足所造成的，这样在进行体外培养时，加入适量的LIF是非常必要的。本实验表明4.5dpc胚胎更适合作为分离培养昆明小鼠ES细胞的材料。【参考文献】 1EVANS MJ, KAUFMAN MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos J. Nature, 1981, 292(9):154156.2MARTIN GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells J. Proc Natl Acad Sci USA, 1981, 78(12):76347638.3RUTH K, Lana RS著，陈英等译. 干细胞研究进展与未来 M. 北京：人民卫生出版社, 2003:323356.4张海锋，单伟，秦书俭. 不同分离方法对鼠胚胎成纤维细胞生长影响的比较 J. 中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11(11):20012004.5KURSAD T. Embryonic Stem Cell Protocols (Vol 2) 2nd ed M. Totowa, New Jersey: Humana Press Inc, 2006(15):149159.6EISTETTER HR. Pluriotent embryonal stem cell lines can be established from disaggregated mouse morulae J. Dev Growth Differ, 1988, 31(3):275282.7WELLS DN. Factors influencing the isolation of murine embryo stem cells J. Theriogenology, 1991, 35(1):293296.8李卫东，张晓刚，常静，等. 昆明小鼠胚胎干细胞的分离培养方法 J. 中国组织工程研究与临床康复, 2008, 12(21):40604064.9董晓，冯书堂，郑行. 小鼠胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代研究 J. 畜牧兽医学报, 2002, 33(5):433438.