选修3 现代生物科技专题专题一 基因工程一、DNA重组技术的工具1、限制性内切酶分子手术刀（1）分布：该酶主要分布于微生物中。在微生物中能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。（2）作用：基因工程中重要的切割工具，能将外来的DNA切断，对自己的DNA无损害。（3）作用部位：在DNA分子内部特定的部位进行切割，切割的是双链DNA分子的脱氧核苷酸链上的两个磷酸二酯键。（4）特点：具特异性，即识别特定的核苷酸序列，并在特定的切点切割。该酶识别和切割部位一般都具有反向重复序列，即一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。切点（5）切割方式举例5GAA TTC33CTTAAG5切点5G AA TTC33CTTAA G5 形成粘性末端粘性末端的特点：一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致，它们之间正好能互补配对，即露出的末端的碱基能互补配对，可以通过氢键连接。这类限制酶在基因工程中最常使用。（6）作用结果：获得粘性末端和平末端的DNA分子片段。在基因工程中为了保证得到相同的粘性末端，必须用相同的限制性内切酶切割质粒和目的基因。2、DNA连接酶“分子缝合针”（1）概念：是将两条DNA连接起来的酶。（2）作用：DNA连接酶的功能是把两个DNA片段末端之间的“缝隙”连接起来。注意：DNA连接酶连接的是磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，而不是两条链之间互补配对碱基之间的氢键，它与限制性内切酶的作用是相反的。限制性内切酶和DNA连接酶的作用部位都是脱氧核苷酸之间形成的磷酸二酯键，只是一个切开，一个连接。 在基因工程中被同一种限制性内切酶切割开来的目的基因和运载体，具有相同的黏性末端，将它们的黏性末端连接起来。就可以形成重组DNA分子。这就需要DNA连接酶来完成此功能，而且这是基因工程中构建重组载体中的必要环节。3、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”（1）作用：与目的基因结合形成重组DNA，并将目的基因导入受体细胞。（2）类型细菌质粒：它是一种相对分子质量较小，独立于细菌DNA之外的小型环状DNA，有的细菌中有一个，有的细菌中有多个，质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可以整合到细菌DNA中，随细菌DNA的复制而复制。噬菌体或某些动植物病毒（3）运载体具备的三个条件能在宿主细胞内稳定地保存并大量复制。具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接。每种没的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适用于多种限制酶切割的DNA插入。具有某些标记基因，以便进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。此外，运载体的存在还需对宿主细胞生存没有影响。二、基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取（1）从基因文库中获取目的基因优点：有了基因文库，就可随时从中提取所需要的目的基因，引入受体细胞使之表达。（2）人工合成目的基因反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。人工合成：根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学的方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。如人的血红蛋白基因、胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。（3）利用PCR技术扩增目的基因PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。目的：获取大量的目的基因原理：DNA复制需要条件：模板DNA、RNA引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）、离子方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后RNA引物与单链相应互补序列结合、DNA聚合酶作用下延伸合成互补链特点：指数形式扩增过程：变性、复性、延伸、重复。步骤名称需要温度过程第一步变性90-95将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90-95，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板第二步复性55-60将反应体系降温至55-60，使两种引物分别与模板DNA链3端的互补序列互补配对，这个过程为复性第三步延伸合成70-75将反应体系升温至70-75，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。2、基因表达载体的构建（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，并使目的基因能够表达和发挥作用。（2）表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。启动子：一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首段。它是与RNA聚合酶结合的部位。终止子：一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾段。作用是使转录过程停止。标记基因：一般为抗生素基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否受体细胞中是否含有目的基因（目的基因是否导入成功）。（3）构建步骤用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口。用同种限制酶切断目的基因，产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。3、将目的基因导入受体细胞（1）目的：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）受体种类不同，导入方法不同受体细胞种类方法植物细胞农杆菌转化法：目的基因插入Ti质粒的T-DNA农杆菌导入植物细胞稳定维持和表达；基因枪法；花粉管通道法动物细胞显微注射法：目的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育新性状动物微生物细胞Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子（3）受体生物不同，所用的受体细胞种类也不相同。植物：可以是卵细胞（受精卵）、体细胞（可经组织培养成为完整个体）动物：受精卵（因为体细胞的全能性受到严格限制）（4）转化实质：目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。4、目的基因的检测与鉴定（1）导入检测：DNA分子杂交法（使用DNA探针）检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，使目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。（2）表达检测转录检测：分子杂交法检测目的基因是否转录出了mRNA，利用DNA分子杂交技术，使目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。翻译检测：抗原-抗体杂交（免疫）法检测目的基因是否翻译成蛋白质。提取蛋白质用相应的抗体静心抗体-抗原杂交，看是否有杂交带。（3）个体生物学水平鉴定：根据其性状，如作物抗性等。三、蛋白质工程1、概念：以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因的修饰或基因的合成，对现有的基因进行改造，或制造一种新的蛋白质，满足人类的生产和生活的需求。2、蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产出天然蛋白质，蛋白质工程是为了生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质。3、基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。 转录 翻译 折叠 DNA RNA 肽链 具有空间结构的蛋白质 表达生物特有的功能或性状 逆转录4、基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸的序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。以上是蛋白质工程特有的途径；以后按照基因工程的一般步骤进行。（目的基因只能用人工合成的方法获取。）5、设计中的困难：如何推测非编码区以及内含子的脱氧核苷酸序列。基因（DNA）DNA合成氨基酸序列（多肽链）分子设计蛋白质三维结构6、蛋白质工程的步骤折叠预期功能 翻译转录生物功能 mRNA7、蛋白质工程与基因工程的比较项目蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能设计蛋白质结构推测氨基酸序列推测脱氧核苷酸序列合成DNA表达出蛋白质获取目的基因构建表达载体导入受体细胞目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品（基因的异体表达）结果生产自然界没有的蛋白质生产自然届中已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现四、转基因生物的安全性1、食品安全问题（1）对转基因生物安全性的疑问：担心出现滞后效应（即过一段时间后才出现不良效应）；担心出现新的过敏原；担心营养成分改变等。（2）实质性等同：指在转基因农作物中只要某些重要成分没有发生改变，就可以认为与天然品种“没有差别”，因此不必再进行安全性检测。对于转基因的安全问题主要是由技术手段不完善、对基因结构和功能的认识局限，特别是从对异种生物基因的结构和功能的了解不足，插入基因位置的随机性等方面考虑的。可以从实质性等同不是转基因食物安全性评价的终点而是起点，还有多环节、严谨的科学性评价，以及实例举证法等方面证明转基因食品是安全的。2、生物安全问题（1）由于转基因作物引入的只是某个基因，而且新性状的表达需要一定的相应的技术及环境条件，不同物种之间存在生殖隔离，花粉的传播距离及存活时间有限，所以一般来讲不大可能对生物的多样性造成威胁。（2）担心有可能会在近缘物种之间通过花粉杂交，造成基因库的污染；杂草或病毒如果被感染外源基因，会成为抗除草剂的超级杂草或重组病毒，有的害虫会获得某种抗性基因，还有的转基因作物可能成为入侵的外来物种，从而破坏生态系统的多样性；可能破坏区域生态平衡3、环境安全问题（1）外源基因扩散到其他物种（外源基因漂移）（2）转基因植物扩散影响生态系统的结构和功能（3）转基因植物扩散对生物多样性的影响（4）转基因植物残体或分泌物对环境的影响（5）重组微生物的中间产物可能会造成二次污染（6）转基因中的某些有毒蛋白或过敏蛋白可能通过食物链进入动物或人体内五、克隆技术引发的伦理问题1、从多利羊的生与死看待克隆人克隆人既有科学发展的内在规律，又有伦理道德观念的约束。从多利羊的生与死的过程中可以看出克隆技术还不成熟，我们坚持