高免血清及卵黄抗体的制备技术免疫血清 1.动物的选择 可作为免疫用的动物多为哺乳类和禽类，主要有家兔、绵羊、马、猪、驴、豚鼠和鸡等，其中实验常用家兔、绵羊、鸡和豚鼠。选择动物时要注意以下几个方面：a.抗原与动物种系 动物性抗原的免疫原性，随动物种系远近而有差别。近缘动物的蛋白质免疫原性弱，反之则强。因此选择动物时应选用亲缘关系较远的动物。b.免疫血清的用量 所需要的免疫血清，如是经常大量地使用，选择免疫动物时则应选择大动物；如所需的免疫血清量不大，则以选择小动物为宜。c.动物的个体状态 用于免疫的动物必须是适龄、健壮、无感染的动物。免疫过程中应特别注意营养和卫生管理。注射抗原1个月后，动物仍无良好的抗体反应，或在规定注射日程后抗体效价不高，可再注射l2次，若仍不佳者立即弃去2.抗原制备与接种 制造抗血清，根据产品不同,所用抗原、制法亦有所不同。病毒性抗血清，一般是用本动物的含毒组织作抗原，首先把强毒接种本动物，使其发病，采取其含毒性组织作为抗原，注射于免疫动物。细菌性血清，是用抗原性好的强毒或弱毒菌种，接种于规定培养基内，于37培养，细菌发育良好者，以纯粹检验后用作抗原。 抗原接种：动物在免疫过程中分为基础免疫及高度免疫。基础免疫一般是注射疫苗，然后连续多次注射强毒进行高度免疫，每次注射剂量，要随着注射次数的增加而增加。接种抗原的次数和剂量，应根据制造抗血清的品种和动物健康情况加以调整。为了获得效价高的抗血清，动物饲养条件必须保持良好。3.血清抗体的检测 免疫程序接近结束时，测定血清的抗体效价，如果效价已达规定的要求，即可视作免疫成功，开始采血。若经试血，血清效价不合格，则可继续增加注射抗原次数或剂量，如再试血仍不合格，应将动物淘汰。 测定免疫血清效价是及时掌握采血时机的重要步骤。常用的有环状沉淀反应(包括抗原稀释法和抗体稀释法)和双向琼脂扩散试验。 用琼脂扩散试验测定血清效价时，如果在抗原孔与抗体孔之间出现沉淀线者，即为阳性。最高稀释倍数血清孔出现沉淀线，即为该血清的抗体效价。琼脂扩散试验的效价通常比环状沉淀反应稍低。4.血清采集与提取 免疫后，经试血，抗体滴度达到要求后可采血。动物采血应在上午空腹时进行，禁食一夜，可避免血中出现乳糜而获得澄清的血清。不论免疫动物是大动物或小动物，采血方法均分一次放血和多次放血法两种。a.一次放血 绵羊或其他大动物可用颈动脉放血，家兔、豚鼠和鸡则可通过心脏直接采血。b.多次少量放血法 大动物可通过静脉采血，家兔、豚鼠和鸡等小动物可通过心脏采血。 免疫血清的分离应在无菌条件下进行，并应尽量防止溶血。采血用的器械、容器等用前要进行灭菌，以无菌操作采血，注入斜放的大试管或三角瓶内，待凝固后分离血清，将多份分离出的血清混合，待检。5.免疫血清的检验 免疫血清的检验包括无菌检验、安全检验和效力检验。无菌检验按成品检验的有关规定进行；安全检验通常用体重1822g的健康小白鼠5只，各皮下注射血清0.5ml，用体重250450g的健康豚鼠2只，各皮下注射血清10ml，观察10天，均应健活，效力检验则按各种抗血清规定方法进行。卵黄抗体免疫血清和卵黄抗体是紧急预防和早期治疗相应传染病的有效制剂。为了降低成本，增加产量，提高治疗效果，对健康母鸡进行法氏囊病高度免疫，取其卵黄来防治法氏囊病,不但省去杀鸡分离血清的麻烦，而且具有产量高、效果好、价格便宜等优点。现以法氏囊病为例，简要阐明高免卵黄抗体的制备。1.制造用鸡的选择 选择健康的蛋鸡，隔离饲养观察l周后无特殊反应者，方可免疫。2.疫苗免疫 通常使用组织灭活苗，其制备过程如下：a.制备鸡的选择选4050日龄SPF鸡，用通过SPF鸡传代的野毒滴鼻、点眼，每只鸡接种0.20.3ml，在4872h左右死亡的鸡，无菌采集其法氏囊，并作病变观察，将病变典型的法氏囊低温保存备用。b.制苗取10g病料加100ml0.5甲醛生理盐水，匀浆、冻融、过滤，滤液加8甘油，置371824h灭活，即为水剂灭活苗，也可加白油等佐剂，制成油乳剂灭活苗。c.无菌检验取灭活苗05ml接种于普通琼脂斜面及厌氧肉汤培养基各一支，于37培养48h，应无菌生长。d.安全试验及保护试验经无菌检验合格的灭活苗，给4050日龄SPF鸡或未经法氏囊疫苗免疫过的健康鸡，肌肉注射、滴鼻、点眼、接种0.30.5ml，观察半月，无法氏囊病发生者，可用1：10强毒0.5ml只攻毒，观察l014天，无发病者为安全有效。免疫程序第一次免疫，每只鸡肌肉注射lml，经710天后进行第二次免疫，每只鸡2ml，7天后用琼脂扩散方法测定卵黄抗体效价，如已达到1：64以上，即可收集高免蛋，如效价不高，可隔7l0天进行第三次加强免疫。3.高免卵黄抗体的制备a.高免蛋的处理高免蛋用0.1新洁尔灭溶液浸泡5min，洗涤干净，放入无菌室晾干备用。b.分离卵黄无菌操作，打破蛋壳，分离蛋黄。c.卵黄匀浆收集的蛋黄置无菌的组织匀浆器中，加等量灭菌生理盐水，并按每毫升加入青霉素、链霉素各1000单位，硫柳汞1.0万，匀浆、过滤,分装消毒瓶内，4冷藏备用。4.高免卵黄抗体的检验a.无菌检验取0.5ml高免卵黄抗体，分别接种于普通琼脂斜面和厌氧肉肝汤培养基，37培养2448小时，应无细菌生长。b.安全检验取30日龄健康鸡10只，每只鸡肌注卵黄抗体2ml，观察57天，应无任何不良反应。c.中和试验取30日龄健康鸡20只，随机分成2组。试验组每只鸡皮下或肌肉注射野毒和卵黄抗体（1：10)混合液1ml，观察饲养1015天，应全部存活，对照组每只鸡皮下或肌肉注射野毒1ml，观察1015天，应部分或全部死亡，剖检后出现典型病变。d.卵黄抗体效价测定用琼脂扩散反应测定，抗体效价应在1：64以上。