第二部分 色谱分析第一章薄层色谱法（TLC）一 薄层色谱法概述薄层色谱法是一种基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或保留而将其分离的方法。与HPLC不同，TLC将固定相涂铺在栽板上，使之形成均匀的薄层。被分离的样品溶液点加在薄层板下沿的位置，再把下沿向下放入盛有流动相（深度约5mm）的密闭缸中，进行色谱展开，实现混合组分分离。被展开的组分斑点即色谱谱带，通过适当技术对色谱谱带进行处理可得到定性和定量的检测结果。薄层色谱法具有技术比较简单，操作容易，分析速度快，高分辨能力，结果直观，不需昂贵仪器设备就可以分离较复杂混合物等特点。二 薄层色谱法中的薄层板、薄层板的涂铺、点样和展开（一）薄层板TLC分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。可通过改变涂层材料的化学组成或对材料表面进行化学改性来实现改变薄层色谱分离的选择性。此外，固定相的物理性质，如比表面积、比空容、平均孔径等也对其色谱行为产生影响。（1）载体 对TLC载体的基本要求为：机械强度好、化学惰性好（对溶剂、显色剂等）、耐一定温度、表面平整、厚度均匀、价格适宜。（2）固定相 TLC固定相包括改性固定相和未改性固定相两类。硅胶和氧化铝是最常用的两种未改性固定相。（3）粘合剂 在制备薄层板时，一般需在吸附剂中加入适量粘合剂，其目的是使吸附剂颗粒之间相互粘附并使吸附剂薄层紧密的附着在载板上。常用的粘合剂可分为无机粘合剂和有机粘合剂两类。（4）荧光指示剂 荧光指示剂是便于在薄层色谱图上对一些基本化合物斑点（无颜色斑点、无特征紫外吸收斑点）定位的试剂。加入荧光指示剂后，可以使这些化合物斑点在激发光波照射下显出清晰的荧光，便于检测。（二）薄层板的涂铺涂板方法可以分为涂布法、倾注法、喷洒法及浸渍法四类，其中涂布法是应用最广泛的涂板方法。TLC固定相薄层涂铺大多采用湿法匀浆，要求薄层均匀、平整、无气泡、不易造成凹坑和龟裂。薄层板活化处理可以获得适宜活性，提高色谱分离效率和选择性。（三）点样点样是TLC分离和精确定量的关键。不同种类的样品常需选用不同的配样溶剂，一般采用易挥发的非极性或弱极性溶剂配样。离子型化合物样品，常需先衍生化成在挥发性强、极性小的溶剂中易溶解的样品衍生物。最适合点样的样品浓度应为（15）gL-1，点样体积视点样技术不同而异。TLC定量分析时，样品量的适宜范围为最小检出量的几倍至几十倍。样品原点一般在1mm左右为佳，原点过大或样品量过大，会导致分离变坏。点样步骤一般占TLC全部分析时间的三分之一左右，所以使点样仪器化、自动化，既快又准，获得好的重复性，是TLC工作者所期盼的。（四）展开TLC展开就是流动相沿薄层（固定相）运动，以实现样品混合组分分离的过程。这一过程需在具有一定形状的展开室中进行。薄层展开有三种形式，直线式展开方式为实际应用中使用最普遍的展开方式。三 薄层色谱流动相与展开机制（一）对流动相溶剂选择的基本考虑薄层色谱溶剂的选择对分离的影响很大。与HPLC同理，对复杂样品的分离能否得到理想的结果，流动相的选择是最重要的因素之一，不同溶质与流动相分子、固定相分子间的作用力不同，因此其移动速度也不同，最终导致样品中各组分的分离。对流动相的选择不仅需考虑极性、选择性等因素，更基本的应注意以下因素的影响：(1)溶剂纯度，含有杂质影响分离。(2)溶剂吸收环境水分，会使极性等性质改变。(3)存放条件不适宜或贮存时间过长，溶剂会变性。(4)混合流动相之间发生作用会使溶剂性质改变。溶剂极易挥发，流动相组成随时改变。（二）几种常用薄层色谱分离模式的展开机制1.液固吸附展开在TLC分离中，液固展开是一种最经典的展开方式。液固展开常用极性吸附硅胶、氧化铝作固定相。流动相依其极性可在吸附剂表面形成单分子或双分子溶剂吸附层，展开过程中，组分的保留及分离选择性主要有以下三种因素决定：a. 溶剂对样品的溶解能力；b. 溶质和流动相分子对固定相表面活性吸附位点的竞争；c. 溶质分子与吸附剂表面上吸附中心间的特殊作用力。2.液液分配展开与液液分配柱色谱分配机理相同，组分在互不相溶的两液相中的溶解度不同，因此迁移速率存在差异，在迁移过程中得到分离。除以上两种展开机制外，还有化学键合相展开和离子交换展开。四 薄层色谱吸附剂与载体的选择1.薄层色谱对吸附剂的要求为：1.具有大的表面积与足够的吸附能力；2.对不同的组分有不同的吸附性，因而能较好的分离不同的化学组分；3.在所用的溶剂和展开剂中不溶解；4.不与试样中各组分、溶剂和展开剂起化学反应或破坏、分解作用5.颗粒均匀、在使用过程中不会碎裂6.具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解吸；7.为便于观察分离结果，最好是白色固体。2.分配色谱对所用载体的要求为：a.表面积大；b.在展开剂中不溶解，与展开剂和样品组成不起化学反应或分解作用；c.对样品组分无吸附性或吸附性极弱；d.对固体液是惰性的。五 薄层色谱扫描仪（一）仪器结构 TLC扫描仪结构主要包括光学元件组合系统、电子元件组合系统及机械元件组合系统。（二）主要功能薄层色谱扫描仪主要用于TLC图被分离斑点和薄层空白的光学相应信号测量。要求仪器光源稳定，光波单色性能好，光波长在（200800nm）检测器灵敏度高。六 薄层色谱定性定量方法（一）斑点定位斑点定位必须采用非破坏性方法。当斑点紫外光显示时，可采用长波长和短波长紫外灯，使用方便、灵活。采用化学试剂显色时，通过手动或电动喷雾器向展开好的薄层板喷洒显色试剂。（二）定性方法1.利用保留值定性在特定的色谱系统中，化合物的Rf值一定，比较未知物和标准物的Rf值，能够作为鉴定未知物的依据。Rf值的准确测定受多方面因素影响，为了增加Rf值定性的可靠性，必须通过改变色谱系统的选择性，重复测定同一化合物的Rf值。如果在分离机理不同的色谱体系中，比较Rf值仍能得到肯定的结果，那么其可靠性将更大。2.板上化学反应定性板上化学反应定性主要有以下两种方式：a. 反应后生成特征颜色的化合物，借以鉴定反应物；b. 反应后生成复杂的、无法鉴定组分的混和物，但可根据生成物的“指纹”特征加以鉴定；c. 除以上两种定性反方法外，还有板上光谱定性、TLC与其他联用技术间接联用定性、薄层色谱傅里叶变换红外光谱联用定性以及薄层色谱质谱联用定性。（三） 定量方法1.间接定量法间接定量法就是将TLC已分离的物质斑点洗脱下来，再采用其他方法对该洗脱液进行定量分析。TLC间接定量的关键是斑点组分的定量洗脱。选用怎样的洗脱方法，取决于，组分和薄层吸附剂的性质。用来洗脱组分斑点的溶剂，对下一步定量方法应无影响。a. 分光光度法 将下来的洗脱液配制成标准体积，再同样条件下对样品和标准液进行吸光值测量。b. HPLC法 以TLC法斑点洗脱液直接作HPLC分离和定量c. GC法 以TLC法斑点洗脱液直接作GC分离和定量。d. 质谱法 采用组分质谱图中的特征离子峰可进行定量。2.直接定量法a. 斑点面积测量法 以半透明纸扫下TLC图上的斑点界限，然后测量其面积。将斑点面积同平行操作的标准样面积相比较进行定量。b. 目测法 将被测样品和系列溶液点在同一薄层板上，展开后用适当方法显色，可以得到系列斑点，将被测样品的斑点面积大小和颜色与标准系列的斑点相比较，可推测出样品的含量范围。这种定量法非常适用于对常规大量样品的重复分析。七 应用实例TLC测定黄曲霉毒素B1 （一）、原理根据黄曲霉毒素B1能在波长365毫微米紫外光下产生蓝紫色荧光的特性，采取薄层层析法，将样品经提取、浓缩、薄层分离后，利用其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定其含量。（二）、试剂1.石油醚：沸程 30602.正已烷3.氯仿4.苯5.乙腈6.甲醇7.无水乙醚：如不是无水乙醚，则应脱水后再用。8.丙酮9.无水硫酸钠10.硅胶G：薄层层析用11.苯乙腈混合液：取苯98毫升，乙腈2毫升，混匀冰箱存放备用。12.三氟醋酸13.黄曲霉毒素消毒剂：5次氯酸钠溶液，取100克漂粉精，加入500毫升水，搅匀，另溶解70克碳酸钠（Na2Co3、H2O）于500毫升温水中，溶后，倒入上述溶液中搅匀、澄清、过滤、备用。14.黄曲霉毒素标准溶液标准储备液（1.02微克/毫升）：GBW(E)090015严格控制、应加锁于冰箱中避光存放。（每次记录用量、余量，以备复查）。稀释液（0.2微克/毫升）取储备液加苯乙腈混合液稀释。稀释液（0.04微克/毫升）取稀释液1毫升以苯乙腈混合液稀释。（三）、仪器1.小型粉碎机2.分样筛一套3.电动振荡器4.电吹风机5.薄层板涂布器（可以自制）6.玻璃板：520厘米7.展开槽：（层析）内长25厘米，宽6厘米，高4厘米8.110毫升刻度吸管9.紫外光灯：365nm，220v，125w，启动电流1.8A10.微量进样器：20微升，10微升11.分液漏斗：125毫升12.蒸发器：60毫升13.玻璃漏斗14.样液瓶：具塞2毫升15.脱脂棉：在索氏脂肪提取器以氯仿提取2小时挥干备用16.电热恒温水浴（四）、操作方法1.提取适用于大米、玉米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等。称取经过粉碎（20目筛）的样品20克于250毫升具塞三角烧瓶中，加正已烷30毫升，甲醇水（5545）100毫升，加塞后加水少许，盖严防漏，振荡30分钟，静置片刻，以脱脂棉过滤于分液漏斗中，待分层，放出下层的甲醇水溶液20毫升（相当于样品4克）于另一分漏斗中，加氯仿20毫升，振摇二分钟，静止分层。另备一漏斗底部铺脱脂棉少许，再加无水硫酸钠10克，下接60毫升蒸发皿，漏斗中的无水硫酸钠先用氯仿湿润。将分层后的氯仿放入已备好的具有无水硫酸钠的漏斗中，过滤，再加5毫升氯仿于分液漏斗中，分层后一并滤于同一蒸发皿中，最后用少量氯仿洗涤滤器，洗液并入以上蒸发皿中。将蒸发皿放入通风橱内于65水浴上通风挥干，然后放在水浴上冷却23分钟，准确加入苯乙腈1毫升。用带橡皮头的滴管的尖端将残渣充分混合，若有结晶析出（苯），将蒸发皿从水浴上取下，继续溶解，混合，晶体消失，再用此管吸取上清液，转移于2毫升样液瓶中，若溶液不够澄清，应离心，或放置等候澄清，取上清液供薄层点板用。注加入氯仿振摇2分钟如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层或用电吹风机吹热风促使分层。含油脂较多的样品如花生等也可采用脱油提取，即称取粉碎样品20克移于滤纸筒内，筒内塞以少量脱脂棉，置于250毫升脂肪提取器内，在7585水浴上以石油醚提取脱油8小时，然后将滤纸筒挥干。将脱油后的样品移于250毫升具塞三角烧瓶内，进行检验。如样品是玉米、大米、小麦时亦可采用下法提取：称取粉碎过筛样品20克于250毫升具塞三角烧瓶内，用滴管滴加6毫升水，使样品湿润，并准确加入氯仿60毫升，振荡30分，加无水硫酸钠12克，振摇静止30分；以脱脂棉过滤取滤液12毫升（相当于样品4克）于蒸发皿，以下步骤与同。适用于花生油、香油、芽籽油等。称取样品4克于小烧杯中，用正已烷20毫升转移于125毫升分液漏斗中，再用甲醇水（55+45）20毫升分数次洗涤小烧杯，洗液一并移入分液漏斗中，振摇2分钟，静止分层后，将下层甲醇水溶液移于第二个分液漏斗中，原分液漏斗中再加甲醇水5毫升，振荡提取一次，甲醇水溶液一并移入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏斗中加入氯仿20毫升，振摇二分静止分层以后按操作。适用于酱油、醋，方法有二：第一