第7章 RNA转录与转录后加工1 本章主要内容1) 转录的基本概念2) 大肠杆菌RNA聚合酶及其转录3) 真核生物的RNA聚合酶及其转录4) RNA的转录后加工和反转录2 教学目的和要求通过本章学习，掌握转录的基本概念，原核转录的主要参与者（RNA聚合酶和启动子）以及原核转录的过程（起始、延伸和终止）。1) 掌握真核转录的三种主要RNA聚合酶、所转录的基因类型和参与转录过程各种因子等。2) 了解不同前体RNA的加工机制。3) 了解反转录的特点3 重点难点1) 转录2) 大肠杆菌RNA聚合酶、原核转录的过程3) 真核生物的RNA聚合酶、真核转录过程、转录因子4) RNA的转录后加工、反转录4 教学方法与手段讲授与交流互动相结合，采用多媒体教学。5 授课内容1) RNA转录概述2) 细菌基因的转录3) 真核生物的转录4) RNA的转录后加工5) RNA的反转录第一节 RNA转录概述 一、 信使的发现 1955年Brachet用洋葱根尖和变形虫进行实验： 若加入RNA酶，则蛋白质合成就停止； 若再加入来自酵母的RNA，又可合成蛋白质。 这表明什么？ 同年Goldstein和Plaut用同位素标记变形虫RNA前体 发现标记的RNA在核内。 标记追踪实验：经过一段时间又发现被标记的RNA在细胞质中， 这表明什么？ 1956年E. Volkin和 L.Astrachan： 用同位素脉冲一追踪标记 表明T2噬菌体新合成的RNA的碱基比和自身的DNA碱基比相似，而和细菌的碱基比不同。T2感染细菌时注入的是DNA，而在细胞里合成的是RNA。 这表明什么？ 最令人信服的证据是Hall.B.D和Spiegeman,S的DNA-RNA的杂交实验： 将T2噬菌体感染E.coli后产生的RNA分离出来，分别与T2和E.coli的DNA进行分子杂交。 结果这种RNA只能和T2的DNA形“杂种”链，而不能和E.coli的DNA进行杂交。Jacob和Monod预言:（1）这种“ 信使”应是一个多核苷酸；（2）其分子平均不小于5105bp,足以携带一个基因的遗传信息；（3）它们至少是暂时连在核糖体上；（4）其碱基组成反映了DNA的序列；（5）它们能高速更新。 Jacob和Monod将它定名为: 信使RNA (Messenger RNA) 或mRNA。二、 几个基本概念 转录(transcription):是指以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚和酶催化下，以4种rNTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。 在有些病毒中，RNA也可以指导合成RNA。 转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。三、 RNA合成的基本特点 1960年Weiss,S,B等发现RNA聚合酶(RNA Pol)。其特点是：（1）以核糖核苷三磷酸（rNTR）为底物；（2）以DNA为模板；（3）按5-3方向合成；（4）无需引物的存在能单独起始链的合成；（5）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在；（6）在体内DNA双链中仅一条链作为模板；（7）RNA的序列和模板是互补的。确定有义链 1963 J.Marmur和Doty Spiegelnan区分有义链。采用枯草杆菌的SP8噬菌体为材料，SP8 DNA 双链有“ 轻”、“ 重”差异明显。 现在将作为转录模板的DNA单链称为模板链或反义链（antisen strand）， 非模板链称为有义链（sense strand）或编码链。 在体外DNA的两条链都可作为RNA合成的模板。 怎样用实验证实mRNA的合成总是延着5- 3方向进行的？ E.coli在 0C时需13秒钟才能加上一个核苷酸，但在37C每秒就可加上40个核苷酸; 利用这个差别以14C来标记U, 在0C培养E.coli，。 提取这种正在伸长的mRNA分子,发现 14C标记首先出现在伸长的3端，因此可以证明合成是延着5-3方向进行的。四、 RNA合成和DNA复制的区别(1) 转录时只有一条DNA链为模板，而复制时两条链都可作为模板；(2) DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放，而DNA复制叉形成后一直打开，新链和母成子链；(3) RNA合成不需引物,而DNA复制需引物；(4) 转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP；(5) 聚合酶系不同。第二节 细菌基因的转录 一、 细菌的RNA聚合酶1. 全酶 (Holo Enzyme)和核心酶(Core Enzyme) (1) 全酶（Holo Enzyme） 用于转录的 依靠空间结构与DNA模板结合 (与核心酶结合后引起的构象变化) 专一性地与DNA序列(启动子)结合 结合常数：1014mol 半衰期：数小时 （107mol 1秒以下） 转录效率低，速度缓慢（ 的结合 ）（2）核心酶（Core Enzyme） 作用于转录的延伸过程（终止） 依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之 间） 非专一性的结合（与DNA的序列无关） 结合常数：1011mol 半衰期：60秒E.Coli RNApol 的亚基组成core enzyme （3）全酶的组装过程 此外，新发现的一种亚基的功能尚不清楚。2. 各亚基的特点和功能（1） 因子 因子可重复使用 修饰RNApol构型 使Holo Enzyme 识别启动子的Sextama Box(35区), 并通过与模板链结合E.coli中不同的s因子可识别不同的启动子（2）因子 核心酶的组建因子 促使RNApol 与DNA模板链结合 前端因子使模板DNA双链解链为单链 尾端因子使解链的单链DNA重新聚合为双链（3）因子 完成NMP之间的磷酸酯键的连接; Editing 功能 (排斥与模板链不互补的碱基); 与Rho （）因子竞争RNA 3end; 构成Holoenzyme 后,因子含有两个位点; I site (initiation site . Rifs): 该位点专一性地结合; ATP或者GTP (需要高浓度的ATP或GTP); E site(elongation site RifR): 对NTP非专一性地结合（催化作用和Editing功能）.（4） 因子参与RNA非模板链（sense strand）的结合 （充当SSB） 有义DNA链结合位点（ 亚基提供） DNA/RNA杂交链结合位点（亚基提供） 双链DNA解链位点（前端 亚基提供） 单链DNA重旋位点（后端亚基提供） 因子作用位点 原核生物RNApol (Core) 的结构与功能RNA pol 执行多种功能(1) 识别DNA双链上的启动子；(2) 使DNA变性在启动子处解旋成单链；(3) 通过阅读启动子序列，RNA pol确定它自己的转录方向和模板链；(4)最后当它达到终止子时，通过识别停止转录。二、 原核生物转录的起始延伸1启动子（promoter）的结构和功能 启动子(promoter)：是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域 ，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。 启动子由两个部分组成l 上游部分 CAP-cAMP结合位点： （基因表达调控的正控制位点） CAP（catabolite gene Activator Protein）降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白l 下游部分 RNApol的进入（结合）位点 35 10 包括识别位点和结合位点（R B位点）2 RNA聚合酶的进入位点（1）Sextama 框（Sextama Box） -35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）结合位点 RNA聚合酶依靠其亚基识别该位点， 为转录选择模板识别位点（R位点） 大多数启动子中共有序列为 T82T84G78A65C54A45 重要性:很大程度上决定了启动子的强度（RNApol 的因子）（2） Pribonow 框（Pribonow Box） -10序列是由Pribnow和Schaller（1975）发现，故也称为Pribnow框盒（Pribnow box）。 -10序列，RNA聚合酶的牢固结合位点 结合位点（B位点） 一致序列：T80A95T45A60A50T9（TATPUAT），因此又称TATA Box 位置范围 4 到13（3）转录起始位点（I） 1位点 RNA聚合酶的转录起始位点 转录开始时模板上的第一个碱基在原核中常为A或G 而且位置固定典型启动子的结构3起始过程(1) 全酶与模板DNA接触，生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动；(2) 起始识别：全酶与35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物（closed binary complex）；(3) 全酶紧密地结合在-10序列处，模板DNA局部变性，形成开放的启动子二元复合体；(4) 酶移动到I，第一个rNTP转录开始,因子释放,形成酶-启动子-rNTP三元复合体（ternary complex）。图起始过程图RNA核心酶和全酶在DNA上的分布: 和1/3的RNA pol结合成全酶，或在非特异位点的松散复合体中，或在启动子中的二元复合体中； 其中半数的核心酶从事转录； 余下的核心酶大量存在于闭合松散复合 体中； 估计数量很少的全酶是游离的。4RNA链延伸三 原核生物转录的终止1 终止子的种类（1） 不依赖 因子的终止子(内在终止子) ： 体外实验中，只有核心酶和终止子就足以 使转录终止（2） 依赖因子的终止子：蛋白质辅助因子 因子存在时，核心酶终止转录 两者有共同的结构特征（序列差异）不依赖 因子的终止子(强终止子) 结构特征: 一是形成一个发夹结构 茎. 720 bp的IR序列形成（富含G/C） 环.中间不重复序列形成 发夹结构的突变可阻止转录的终止 二是6 8 个连续的U串(发夹结构末端)、依赖 因子的终止子a 结构 IR序列中的 GC 对含量较少 发夹结构末端没有固定特征b 靠与的共同作用而实现终止2 原核生物转录的终止（1）不依赖因子的终止子终止转录新生RNA链发夹结构形成 造成高度延宕（典型的有60秒左右）RNApol暂停为终止提供了机会 ，6 8个连续的U串可能为RNApol与模板的解离提供了信号 RNADNA之间的 rUdA 结合力较弱 于是：RNA