结核杆菌培养基的种类及应用 【关键词】 结核杆菌 自从1882年Koch发现结核杆菌以来，为促进结核杆菌生长，缩短培养时间，达到提前分离、鉴定的目的，人们对结核杆菌的营养、生理代谢及人工培养进行了一系列的研究，经过一个多世纪的不懈努力，已经对结核杆菌的生长规律有了比较深入地了解，并且形成了许多成熟的培养方法。尽管现代分子生物学技术在结核病研究中发挥着越来越重要的作用，但是结核杆菌的培养在结核病的诊断、流行病学指标、结核菌的分型鉴定、药敏试验、结核病药物的研究等方面依然有着不可替代的作用。为了能够较系统地了解、有针对性地选择合适、恰当的培养基，本文就国内外较为成熟的培养基种类及应用进行如下综述。 1 按培养基的性状分类 培养结核杆菌的培养基，从性状上分主要有固体培养基、液体培养基、半流体培养基、固液双相培养基等类型，这些培养基各有特点。 固体培养基 最常用的是罗氏（Lownstein-Jenson，L-J）培养基，也是最具代表性的一种，其他的还有小川辰次（Tatsujiogawa）鸡蛋培养基和Middle brook 7H10、7H11等琼脂培养基等。在固体培养基中，由于可以直接观察菌落的形态并可做鉴别用，因此常用于临床标本的分离培养、鉴别、保存菌种及对抗结核药物的敏感性测定等方面，缺点是结核菌生长缓慢。 液体培养基 常用的有苏通（Sauton）培养基、Middle brook 7H9等液体培养基。结核杆菌在液体培养基中能够更广泛的接触营养成分，因此在液体中生长相对较快,主要在液体表面生长，搅动时下沉至管底，可获得大量的结核杆菌。主要缺点是：在对临床标本的收集、采样、运输方面有不利的一面；不能根据肉眼观察菌落形态；培养基污染机会多，影响结核杆菌的生长，污染时不易与结核杆菌鉴别，需涂片染色镜检判断结核杆菌是否生长。 半流体培养基 改良苏通半流体琼脂培养基是一种人工综合培养基，基质透明，呈半流体状态，生长的结核杆菌形成白色颗粒状菌落悬浮于培养基中段，便于观察。 固液双向培养基 Septi-Check AFB双相培养基是国外应用较早的一种培养基1，采用BD专利式封闭式固液双相一体化培养基设计。液相为Middle brook 7H9分枝杆菌专用增菌培养基，可迅速繁殖分枝杆菌，固相为3种固体培养基平面：Middle brook 7H11和改良的L-J培养基用于及时将增菌肉汤内分枝杆菌进行分离纯化以获得单个菌落，巧克力琼脂用于早期发现污染菌，避免时间浪费。由于有液相作为基础，因此结核杆菌生长较快，也是一种非常有效的培养基。国内有用平菇制备的平菇双相培养基2是利用平菇浸出液为基础，加小牛血清、琼脂等成分而配制的一种培养基，根据琼脂的量不同制成液相、固相培养基。在国内应用较少，主要特点是成本低，制备简单，适合于基层使用，有一定的研究价值。 2 按成分分类 主要分为以鸡卵和琼脂为基础的两种培养基3。为了使结核杆菌达到快速生长的目的，可加上血液、椰汁、平菇液等不同营养成分，从而配制出各种不同的培养基。 以鸡卵为基础的培养基 有L-J培养基、Ogawa培养基、丙酮酸钠培养基和丙酮酸钠细胞色素C培养基等。在鸡卵为主的培养基中，鸡卵液是关键成分，在制备培养基时，要充分考虑鸡卵液的新鲜程度以及营养成分是否受到破坏。 L-J培养基 是一种经典的培养基4，主要成分有天门冬素、KH2PO4、MgSO47H2O、枸橼酸镁、甘油、鸡卵液等，需要血清凝固器对培养基进行凝固，以保证培养基中有一定的凝固水，以满足长时间培养的需要。根据成分种类及剂量的不同，又可分为酸性L-J培养基和碱性L-J培养基。将L-J培养基中KH2PO4的量由增加为14g，就是酸性L-J培养基，而将改为，就是碱性L-J培养基。L-J培养基制备简单，主要用于分枝杆菌初次分离培养、传代培养、菌落观察、保存菌种、药物敏感性测定及菌种鉴定等，而酸性L-J培养基和碱性L-J培养基用于分枝杆菌分离培养时，标本分别用碱和酸处理。结核杆菌在L-J培养基上生长时，培养时间较长，大约在48周，因此不利于临床快速检测的需求，但作为其他快速诊断的参照，以及作为结核杆菌诊断的标准有非常重要的意义。 Ogawa培养基 成分较少，又少了天门冬素，因此是一种比L-J培养基更为经济的培养基，主要成分有谷氨酸钠、KH2PO4、甘油、鸡卵液等，还可以通过调整KH2PO4的量及谷氨酸钠的量制备成改良培养基（Modified Ogawa），此培养基的用途与L-J培养基相同，由于价廉，特别适合于发展中国家5。 丙酮酸钠培养基 是在L-J培养基的基础上加入丙酮酸钠，除去甘油制备而成，主要用于从标本中分离牛型分枝杆菌或作为本菌的传种及保存。而丙酮酸钠细胞色素C培养基是在Ogawa培养基基础上，杨乐荫等用%丙酮酸钠代替甘油，并加入%葡萄糖液及细胞色素C制成丙酮酸钠细胞色素C培养基，与丙酮酸钠培养基、Ogawa培养基对临床标本比较，其培养的培养阳性率最高，显示了丙酮酸钠细胞色素C培养基的优越性。 以琼脂为基础培养基 包括苏通（Sauton）培养基Middle brook 7H9、7H10、7H11、7H12，匡氏培养基Proskauer培养基和Beck琼脂培养基等。这些培养基主要是由无机盐类及一系列的有机化合物等成分组成。琼脂的作用主要是赋形剂，通过调整琼脂的量，一方面可以制备成不同性状的培养基；另一方面，在液体培养基中的少量琼脂有利于结核杆菌在中段形成菌落，从而便于观察。 Sauton培养基6 主要成分有天门冬素、K2HPO4、MgSO47H2O、柠檬酸、枸橼酸铁铵、甘油等，根据是否加入琼脂及琼脂的量，又形成了液体培养基及半固体培养基（也称改良苏通半流体培养基）等。在培养基的制备上，也不需要特殊的设备，通过高压灭菌法既可处理培养基，因此操作简单，主要用于牛型分枝杆菌的培养，卡介苗的生产及中草药对结核杆菌的作用的研究中。 Middle brook系列培养基 是国外最常用于结核杆菌研究和诊断目的的培养基之一，从成分上看，最大的特点是成分多、配制复杂6，但是培养时间短，因此越来越受到国内外学者的关注，其中7H9、7H12为液体培养基，7H10、7H11为固体培养基。通过在培养基中加入标记14C的棕榈酸，当有分枝杆菌生长时，就可利用培养基中的标记物而产生有放射性14CO2,然后由BACTE TB 460监测系统检测其含量，因此非常敏感。Middle brook系列培养基主要用于分枝杆菌培养及药物敏感性的测定。 Proskauer培养基和Beck琼脂培养基 使用简便，但是菌落不典型，呈扁平状、露滴状，多为光滑型7。 3 按目的分类 在前述的培养基基础上，根据研究目的不同，加入特定物质后，可以制备成用于快速培养、鉴别、药敏等不同用途的培养基，主要为了满足临床的需要。 用于快速培养 主要有Becton Diskinson（BD）公司研制的系列全自动培养系统和Organon Teknika公司研制开发的培养系统。其的还有Difco公司ESP系统、生物梅里埃公司的VITAL系统等。由于与现代先进的仪器设备、技术结合，检测灵敏度高，时间短，但通常价位较高。 20世纪70年代末，BD公司研制的培养系统主要有早期的BACTEC 460TM TB，成为全球第一台专业的全自动分枝杆菌培养鉴定仪，该系统培养基以Middle brook7H12为基础，在培养基中加入标记14C的棕榈酸，因故也称为放射同位素液体培养法，由于存在废弃物放射性环境污染以及探针空刺开放性检测技术缺陷，公司又推出无放射性污染的BACTEC 9000MB及BACTEC MGIT 960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏系统，真正实现了分枝杆菌快速、安全、无放射性检测。BACTEC MGIT 960培养基以Middle brook 7H9为基础，配方优良的BBL PANTA TM抗菌剂和OADC营养剂。采用一种荧光物质作为分枝杆菌生长指示剂，因此也称为分枝杆菌生长指示管法（mycobacteria growth indicator tube，MGIT），是目前全球最快的分枝直菌培养、鉴定、药敏系统。许多学者810应用发现，结核分枝杆菌平均检出时间为天,最快10天。适用于多种标本来源，对各种分枝杆菌检测都适用。 MB/BacT分枝杆菌培养系统是由Organon Teknika公司开发的，将血液培养中判断细菌生长的pH指示剂用于结核杆菌的培养。结核杆菌代谢中产生的CO2变化通过化学感受器监测，利用酸碱度的变化使pH指示剂颜色改变，最后通过发射光度计检测颜色变化。其平均检测时间比LJ早2周。该系统依然采用Middle brook 7H9液体培养基，当有阳性信号时，需取培养液进行涂片及鉴定确认。 Difco公司ESP系统,是一种全自动的血培养系统，可以连续监测细菌的生长。具有无放射性的特点，与BACTEC TB 460比较11，12，在检测时间上差异无显著性,可以替代使用，Williams-Bouyer N等将ESP与BACTEC MGIT 960进行了详细比较13，在整体检测时间上稍长些，对戈登分枝杆菌监测率高。作为一种液体培养基,需要与固体培养基结合使用,而不能作为一种独立系统。 我国学者根据国内具体情况，利用血液、椰汁、植物激素、平菇液、豆浸液等不同营养成分，配制成多种不同的快速培养基。如用平菇制备的平菇双相培养基，在落实培养基基础上的豆浸液培养基、植物激素培养基等。 用于选择 由于结核杆菌生长缓慢，且营养要求高，因此对于其他的微生物极易生长，通常在培养基中都加有抑菌物质。在罗氏培养基中，微量孔雀绿既可抑制杂菌的生长，又可对结核杆菌的生长有促进作用。Gynft通过把孔雀绿的浓度提高，同时1 / 1