水稻转基因系的分子鉴定1目的1.1 从T2不同转基因株后代中鉴定得到分离出的纯转基因株、杂合转基因株和非转 基因株，为根系和生理学实验提供材料；1. 2 鉴定纯转基因株中插入T-DNA的拷贝数和插入方式；1. 3 鉴定纯转基因株中插入T-DNA的插入位置。2. 材料中华 11 （ CK）H05 系列石狩白毛（CK）E10 系列WD17 系列3. 主要试剂和配方3.1 DNA微量提取微量提取液：200mM Tris-HCl（pH7.5250mM NaCl25mM EDTA0.5% SDS酚/氯仿氯仿无水乙醇、 70%乙醇TE缓冲液（pH8.0）10mg/ml RNase3.2 Htp的PCR鉴定Taq酶及Buffer购自Takara公司dNTPs 购自华美公司3.3植物DNA大量提取抽提液：1.5%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）75mmol/L Tris-HCl PH8.01M NaCl15mmol/L EDTA沉淀液：1%CTAB50mmol/L Tris-HCl PH8.010mmol/L EDTA高盐 TE:1mol/L NaCl10mmol/L Tris-HCl PH8.01mmol/L EDTA3. 4 Southern 杂交Southern杂交液(lx) :20xSSC250 mL5%SDS5 mL10%Sarkosyll0 mLddH O735 mL2Blocking Reagent5 g洗脱液(lx)：20x SSC10 mL5%SDS40 mLddH O950 mL23.5 RNA提取Trizol：购自 Invitragen公司10xMOPS:80mmol/L NaAc0.2mol/L MOPS10mmol/L EDTA加DEPC处理的水定容，调pH值至7.0RNA上样混合物：0.25%溴酚兰0.25%二甲苯菁50甘油1 mmol/L EDTA1.2% 甲醛变性胶(100ml)：1.2g grose73ml DEPC 水 10xMOPBuffer 10 mL 2.2M 甲醛6 mL3.6 RT-PCR反转录酶Superscrip till试剂盒购自Invi tr agen公司 PCR所用试剂同前。3.7 Norther n分析Northern杂交液(1X)：2OXSSC25 mL10%SDS5 mL10%Sarkosyl5 mL1MTrisHcl(ph7.5) 5mlddH2O10 mLBlocking Reagent 1 g甲酰胺50mL4方法4. 1 DNA微量提取取水稻幼小叶片约 5cm 长,加液氮研磨后加微量抽提液 400ul 摇匀，加等体积的酚/ 氯仿摇匀后放置10分钟，5500rpm常温离心10分钟，取上清液于另一个新管，加400ml 氯仿摇匀放置5分钟，5500rpm常温离心10分钟，取上清液于另一个新管，加2倍体积 无水乙醇沉淀5分钟，离心3分钟后弃上清液，70%乙醇洗2次，风干后30U10.5XTE溶 解， 4C 保存备用。4. 2转基因系的PCR鉴定取适量转化苗DNA进行htp基因的PCR反应，反应总体积为25ul,30个循环，产物于 1.3%的琼脂糖凝胶电泳检测，初步鉴定转化苗。样品：阴性对照：阳性对照：样 品：PCR反应液组成：引物：0.5uMdNTP:100uMBuffer:2.5ulTaqE:1UDNA:20-100ngddH2O:add to 25ulPCR 条件：94C 9 4C 58C 72C 7230 cycles2m 30s50s 1m 5m引物序列：htpF1: GTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGhtpR1: GTCCGTCAGCACATTGTTGGAG4. 3 插入拷贝数与插入方式的确定4.3.1转基因植株DNA的提取（CTAB法提取）将PCR鉴定的转基因株分单株取叶片35g，放入预冷的研钵中，加入液氮，将叶片 研磨成粉末，倒入50m L离心管中。加入20m L预热到80C的CTAB提取液摇匀。56C水 浴保温1520分钟，并经常拿出来摇动几下。加入15m L氯仿，摇匀后，平放在摇床上剧 烈摇动10分钟。室温下3500rpm离心15分钟。移上清液至另一离心管，加入1/10量的10% CTAB，摇匀。加入15m L氯仿，混匀后，在摇床上激烈摇动15分钟。室温下3500rpm离 心15分钟，移上清至另一离心管，加入等量的沉淀液，摇匀后放置1015分钟。将沉淀的 絮状物用牙签勾起，倒尽上清并尽可能地把残液吸除（如果沉淀量少，则用 3500rpm ，室 温下离心 10分钟，弃去上清液并用移液器将残液尽可能除去）用吸管头将沉淀扩散到管壁 上，加入35m L高盐TE和0.05mg RNA酶。在65C摇床中轻摇至完全溶解。加入2倍体 积无水乙醇，摇匀。用牙签钩出DNA,经70%乙醇漂洗，风干后溶于0.20.5m L TE。取 1此溶液和标准浓度的九DNA 起在0.8%琼脂糖凝胶中电泳检测DNA质量。4.3.2 酶切转膜选用HindiII限制性内切酶酶切转化植株总基因组DNA, 37C酶切12小时左右。先取 少量进行预电泳检测酶切效果，然后用0.8%的琼脂糖凝胶进行低电压电泳或反转电泳。电 泳后将大片段的凝胶部分用紫外灯照射15分钟左右，再用0.4 mol/L NaOH进行碱法转移8 12小时，将胶上的DNA转移到Hybond-N+尼龙膜上。转移结束后，将尼龙膜放入一干净盒 子,先用2xSSC溶液简单漂洗后，再用煮沸的0.5% SSC/0.5% SDS溶液倒入，摇动数分钟， 重复两次。用微波炉烤3 分钟或在紫外交联仪上交联1 分钟，之后用保鲜纸把膜包好， 4C 下保存备用。4.3.3 探针获得及标记探针采用随机引物法标记，体系为25p L。取50lOOng已回收好的HPT PCR产物为模 板，加入2p L （0.5 g/ L）随机引物和lng的入DNA，补充ddO至10p L后，放入加热板 或PCR仪95C变性3分钟，取出立即冰浴5分钟。然后加入2.5p L标记缓冲液（含dATP、 dGTP、dTTP）、2U的BST聚合酶、3050p Cia -32P-dCTP, 65C反应0.5小时，反应完后加 入等体积的 0.8 mol/L NaOH 将探针进行碱变性。434 预杂交及杂交按0.20.5 L /m2杂交膜面积的量，将杂交液加入放有尼龙膜的杂交管中，65C预杂 交12小时，然后将变性后的探针加入到杂交液中,65C杂交炉中杂交过夜（1416小时）。435 洗膜及杂交信号检测杂交完后，先用少量洗膜液（0.2XSSC / 0.1% SDS）室温下冲洗一次，然后用预热至 65C 的洗液在摇床中洗约30分钟，更换洗液再洗3060分钟。洗完膜后，用保鲜膜包好， 压上分子磷屏。12小时后，用BIORAD FX成像系统扫描，分析杂交结果。436 探针的洗脱 磷屏扫描后，将杂交膜从保鲜膜中取出，放入煮沸的洗膜液中，继续煮数分钟至信号 降至本底为止。已洗脱探针的尼龙膜可以重复使用。44 插入旁侧序列获得及插入位点的确定用刘耀光教授发明的TAIL-PCR方法获取插入点旁侧基因组序列，右边界旁侧序列扩增 第1、2、3轮特异引物分别用NOS3b、Nos3c、Nos3d,左边界旁侧序列扩增第1、2、3轮特 异引物分别用35S-1、35S-2、35S-3，兼并引物用AD2a或AD2或AD2c （具体见后）。扩增产物回收并测序，用序列在水稻数据库中搜寻BAC/PAC序列，即可确定插入的位点。TAIL-PCR 所需引物：AD2a:5 NTGCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA 3AD2b:5 NTGCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA 3AD2c:5 NTGCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA 3Nos3b:5 TGCATGACGTTATTATGAGAGATGGGTT 3Nos3c:5 TATGATTAGAGTCCCGCAATTATACA 3Nos3d:5 ATTATCGCGCGCGGTGTCA335S3-1:5 TAGGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCA 335s3-2:5 GTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAG 335s3-3:5 CCTAAAACCAAAATCCCTTAG 3TAIL PCR 所需的程序及反应体系ReactionCycle no.Thermal condi tionPrimary194 C3min594 C30s,65C1min,72C 3min194C30s,30C2min,ramping to72Cover2min, 72C 3min1594C 15s,65C 1min,72C 3min94C 15s,65C 1min,72C 3min94C 15s,45C 1min,72C 3min172C5minSecondary1594C15s,65C 1min,72C 3min94C15s,65C 1min,72C 3min94C15s,45C 1min,72C 3min172C5minTertiary2094C15s,45C 1min,72C 3min72C5min反应体系PrimarySecondaryTerti aryVolumeTemplate20卩LRice genome DNA 20ng25卩L1/800reaction50卩LPrimary 1/250 Secondary reaction10X Buffer2卩L2.5卩 L5卩LdNTP100卩M each100卩M each100卩M eachSpecific0.15卩 M(MR1 or TR1)0.2 卩 M(MR2 or TR2)0.2卩M(MR3 or TR3)primerAD2a primer2卩M1卩M1卩MTaq1U0.8U1.5U45 目的基因表达（干涉效果）的检测4. 5. 1转化植株总RNA的抽提分单株选取lOOmg转化植株叶片在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5mL离心管，加 入ImLTriZOL提取液振荡混匀。5分钟后，加入0.2mL的氯仿，剧烈摇动15秒，30C反应 23分钟。在12000Xg条件下，8C离心15分钟，溶液分为两层，上层为溶有RNA的无色 液层，下层为酚-氯仿浅红色液层。将上层液体移入RNA专用1.5mL离心管，再加入0.2mL 的氯仿混匀、离心。移上清至另一新的干净离心管，加入0.5mL异丙醇，30C沉淀10分钟, 然后在12000Xg, 8C离心10分钟沉淀RNA。去掉液体，加