动物饲料 双歧杆菌属的分离和计数双歧杆菌：对人类肠道健康的重大意义Ishibashi N,Yaeshima T and Hayasawa H.Morinaga Milk Industry Co. Ltd., Nutritional Science Laboratory, 5-1-83, Higashihara, Zama-City, Kanagawa, 228-8583, Japan绪论双歧杆菌的发现史与生物学特性双歧杆菌最初是由法国巴斯德研究院的Tisser在1899年从一名健康的母乳营养儿粪便中分离得到的。其归属于放线菌科双歧杆菌属，专性厌氧，革兰氏阳性，不产芽孢。最初被命名为Bacillus bifidus communis(普通双歧杆菌）。此命名显示了双歧杆菌的分支形态，bifidus在拉丁文中是分裂成两部分的意思。后来，双歧杆菌作为双叉杆菌（L.bifidus）一度归属于乳杆菌属（Lactobacillus）。在20世纪60年代，双歧杆菌作为独立类别被人们所接受，并归于双歧杆菌属（Bifidobacterium）。除上述提到过的特性外，双歧杆菌最重要的表现性特征是能发酵葡萄糖产生大量乳酸和醋酸。双歧杆菌的种类与分类 目前，世界上大约有30种已知的双歧杆菌。栖居于人类肠道内的双歧杆菌与栖居于动物肠道内的双歧杆菌截然不同（Mitsuoka，1984）。存在于人体内典型的双歧杆菌有长双歧杆菌（B.longum），短双歧杆菌（B.breve），婴儿双歧杆菌（B.infantis），两歧双歧杆菌（B.bifidum），青春双歧杆菌（B.adoltescentis）和假链状双歧杆菌（B.pseudocatenulatum）。动物体内的代表则是家长双歧杆菌（B.pseudolongum），嗜热芽孢杆菌（B.thermophilus）和动物双歧杆菌（B.animalis）。动物肠道内的双歧杆菌从未从人体肠道中分离出来，同样的，动物道内也从未发现过人体肠道内的双歧杆菌。双歧杆菌的）一宿主专一性原因不得而知，但可推断这是由于不同种类的菌在宿主肠道内的繁殖能力不同造成的。在制作不同种类酸奶的双歧杆菌中，动物型双歧杆菌（B.animalis）是经常被使用的一类菌（Yaeshima et al，1996）。这是因为动物体内的双歧杆菌更耐酸，因此，他们可以在酸奶中更好的生存繁殖。最近，人们发现，从这种酸奶中分离出的动物型双歧杆菌品系同其他的动物型双歧杆菌相比，有一些遗传上的不同，人们命名这类菌为益生菌（乳酸双歧杆菌，B.lactis）（Meile et al，1997）。益生菌同样也不能在人体肠道内生存，因此食用含人体双歧杆菌的食品补充剂不失为明智而又正确的选择。人类的肠生态在出生之前，胎儿呈无菌状态，体内没有大肠杆菌的存在。在出生时，各类细菌迅速进入胎儿肠道内生存繁殖，构建起肠道菌群，但双歧杆菌逐渐成为主要细菌并在新生儿时期成为优势菌。双歧杆菌的这种变化趋势也是母乳营养儿的特殊标志。据研究表明，双歧杆菌占母乳营养儿肠道菌群数的95%以上（Yoshiokaa et al，1991）。母乳营养儿逐渐增强的免疫力或许就归功于在肠道菌群中占优势的双歧杆菌。人工喂养儿肠道内的双歧杆菌数较母乳营养儿要少。尽管如此，双歧杆菌依旧是人工喂养儿肠道内的优势菌。婴儿断奶后，在新生儿时期成为优势菌的双歧杆菌数量逐渐减少，而拟杆菌属（Bacteroides）和真菌类（Eubacterium）则成为优势菌。图一反映了双歧杆菌数随年龄增长的变化（Mitsuoka，1978）。从图中可以看出，即使在成年期双歧杆菌也是肠内菌群的重要组成之一。在老年时期，伴随着梭状芽孢杆菌（Clostridium）和其他类细菌数量的增加，双歧杆菌数大量下降。图二对比了母乳营养儿和成年人粪便的电子显微镜照片。从照片可观察到，母乳营养儿粪便中的可见菌几乎只有双歧杆菌而无其他菌，而成年人粪便中的可见菌绝大部分是杆菌和球菌，双歧杆菌数很少。在粪便中培养的微生物菌群也可观察到这一区别。肠道菌群的种类及数量随年龄的增长而改变，在这期间，还伴随着双歧杆菌数量的减少。表一展示了肠内菌群的变化对肠环境的影响。这些菌类产生的腐败物如氨气、吲哚和酶活等的浓度，母乳喂养儿较成年人相比低得多。尽管这些变化不能完全归因于肠内菌群的不同，但也产生了很大影响。 成年人肠内菌群是由大约100种细菌构成，每克结肠有10101011个（图3）。依据细菌对肠环境的影响，可将其分为三类：有益菌、有害菌和中性菌。有害菌具有致病性，可将食品组分转化为有害物质，这类细菌包括梭状芽孢杆菌（Clostridium），韦荣氏球菌（Veillonella），变形杆菌（Proteus）和肠杆菌属（Enterobacteriaceae）。有益菌以双歧杆菌（Bidobacterium）和乳杆菌（Lactobacillus）为代表，它能抑制有害菌的生存繁殖并发挥多种有益生理作用，对宿主无毒害作用。在大肠中，乳杆菌数约是双歧杆菌数的1/100，对肠环境的影响也比双歧杆菌小。最后，中性菌包括拟杆菌属（Bacteroides），真菌（Eubacterium）和厌氧链球菌（anaerobic streptococci）。在正常环境下，中性菌不显致病性，但当宿主免疫力或抵抗力下降时，它们可能造成机会性感染。图三展示了肠内菌群与人类健康间的相互关系。许多细菌分解产生有害物质，例如：氨气、胺、硫化氢和吲哚等蛋白质。脂肪的消耗加速了机体胆汁酸的分泌，肠道细菌又将胆汁酸转化为次级胆汁酸，而次级胆汁酸有致癌潜力。这些都表明肠道细菌对肠环境有很大影响，肠环境又进一步影响宿主健康。肠道细菌数受某些因素如食物和生存环境的影响，同时，它们也彼此竞争。这就导致了肠道菌群的改变。一个良好的肠内菌群环境可以营造健康的肠环境。低数量的有害菌和以双歧杆菌为代表的高数量的有益菌共同构成了良好的肠内菌群环境。双歧杆菌的生理效应这一节将描述双歧杆菌实际的生理效应。首先，最重要的是其肠道调节的作用。也就是其改善肠道环境的整体效果的作用，其中包括改善肠道菌群，抑制肠内腐败物质生成，改善粪便性质和排便的状态（减轻便秘或腹泻 ）。正如前面提到的，除了乳酸，双歧杆菌产生的醋酸也具有强大的杀菌作用。且在体外也能起作用(Araya-Kojima et al, 1995)。表2比较了分别食用了含双歧杆菌酸奶 (B. longum BB536) 和不含双歧杆菌酸奶后，肠道双歧杆菌相对数量（）和其他肠道主要菌相对数量（）的变化(Yaeshima, 1997)。其中可以看出食用含双歧杆菌酸奶可显著提高双歧杆菌在肠道菌群中的比例，且氨产生量明显减少（图4）。图5显示了食用这种酸奶对排便频率和便秘的影响。可看出食用这种酸奶后排便频率的显著提高。对于早产的体重小于或等于1000g的新生儿，适量的双歧杆菌的摄入B. breve M-16V (Akiyama et al, 1994), B. longum BB536 (Akiyama et al, 1994) 有利于双歧杆菌的早期繁殖和双歧杆菌菌群的形成，可减少坏死性小肠结肠炎和和其他肠道疾病的发生。双歧杆菌的下一个重要作用是免疫激活作用。小肠细胞或细胞组件诱导特异和非特异性的抗体、非特异性抵抗毒素的产生和抗肿瘤效果已被报道过。小鼠单相关长双歧杆菌BB536，通过增加总免疫球蛋白IgA抗体的特异抗体的效应来增加生产能。观察到的电阻采集到的致病性大肠杆菌（Yamazaki等人1991）。B.Infantis的细胞壁已被证明能抑制小鼠纤维肉瘤（Sekineetal,1985）。双歧杆菌也表现出抗肿瘤活性。现已有报道冻干的B.longum BB536具有抑制癌症或通过诱导咪唑并喹啉衍生物（IQ）（Reddy&Rivenson1993）或氧化偶氮甲烷形成的异常隐窝病灶（Kulkarni和Reddy1994）（ACF）形成的作用。图6显示了冻干长双歧杆菌在IQ引起的各种器官癌变BB536中作用的结果(Reddy & Rivenson 1993)。IQ能在小鼠的肝，肠，和乳腺腺诱导癌症，但B.BB536能抑制所有这些器官的癌症，特别是在大肠中抑制作用可达100%。现有报道B.Longum BB536伴乳果糖对有ACF抑制有积极作用（Challa等人，1997）。B.longumBB536也被证明可通过增强钙吸收来增加骨强度的作用（Igarashi等人，1994）。双歧杆菌的生长因子早期对双歧杆菌生长因子的研究是关于其在体外增长的推动因素。这些研究发现体外生长因子包括含N-乙酰氨基葡萄糖-低聚糖，蛋白质的酶分解产物，糖蛋白和泛硫乙胺化合物(Rasic & Kurmann 1983)。随后关于体外生长因子的研究变得普遍，乳果糖(Petury 1957, Terada et al, 1992) 和膳食纤维也被证明能有效促进肠道双歧杆菌的生长。这些低聚糖有几个重要属性。它们在人体消化道中基本不被吸收，最后在大肠优先被双歧杆菌利用。图7显示了改变乳果糖量对双歧杆菌在肠道菌群中比例的影响 (Terada et al, 1992)。当乳果糖摄入为3克/天时双歧杆菌的比例明显升高，当乳果糖停止摄入时其比例也随之降低。并且乳果糖的摄入能抑制粪便氨和其他腐败物质的生成。因此乳果糖作为一种双歧杆菌生长因子仅需要一个较小的剂量就能有效促进肠道双歧杆菌的生长。利用这个属性,乳果糖一直被用作治疗肝性脑病和alleviatig便秘。乳果糖能控制这些疾病是因为它在肠道中促进双歧杆菌的生长，抑制氨的产生，且代谢的有机酸促进肠道蠕动。乳果糖因其能很好的帮助建立肠道双歧杆菌菌群而被添加到大量食品中，特别是婴儿食品(Tamura et al, 1993)。双歧杆菌的应用因为有上文提到的生理学上的积极作用，现在双歧杆菌被广泛应用于食品、医药、动物饲料等行业。摄入这种类型的产品，使有利的双歧杆菌进入到肠道中改善肠道菌群，进而改善肠道环境，有助于维持肠道的健康，以达到预防或改善肠道疾病的最终目的。在德国双歧杆菌在食品中的应用已有一段历史(Mayer,1948)，日本也在九十年代初开始在食品中对其进行利用(Ishibashi, 1993)。后来遍及到欧洲,目前已在全球范围内使用(Tamime et al, 1995)。双歧杆菌在食品中的应用最具代表性的是双歧杆菌酸奶。另一个流行的产品是在未发酵的牛奶中添加双歧杆菌的双歧杆菌牛奶。在食品中添加双歧杆菌是认为其能为肠道提供有活力的菌，但是在保质期内维持酸奶或牛奶中双歧杆菌活性需要较高水平的技术。如在牛奶中双歧杆菌的生长需要特殊的生长促进物质。此外双歧杆菌严格厌氧，对氧气十分敏感。所以需要有特殊技术使在整个生产过程中没有氧气。现在冻干粉生产技术已经取得了巨大进步，其生产的每克中含有1010到1011个有活力的细胞的产品已经投入市场作为食品添加剂。高质量的冻干粉可以在室温下长期保存一年以上，它可以以多种形式和应用在健康食品、药品、粉胶囊和药片等产品中。双歧杆菌分离培养鉴定1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 恒温培养箱：36 1 。 2.2 气相色谱仪配FID检测器。 2.3 冰箱：2 5 。 2.4 天平： 感量0.1 g。 2.5 无菌试管：18 mm180 mm、15 mm100 mm。 2.6 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL刻度）或微量移液器（200L1000L）及配套吸头。 2.7 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。2.8 显微镜2 培养基和试剂 3.1 BS培养基