Pierce Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit（26149）中文说明书介绍：Thermo 公司的Pierce免疫共沉淀试剂盒，可通过将铆钉抗体固定在琼脂糖支撑物上，从裂解液中或其他复杂混合物中，分离出天然蛋白复合物。Co-IP是一种研究蛋白与蛋白相互作用通用的方法，该方法使用一种诱饵蛋白与抗原进行免疫沉淀反应，然后可通过免疫共沉淀任何与诱饵蛋白具有相互作用的猎物蛋白。传统的Co-IP方法使用蛋白A或G共同洗脱抗体的重链和轻链，这很可能导致将相关的蛋白一起洗脱下来，掩盖一些重要的结果。Pierce免疫共沉淀试剂盒通过将共价结合抗体固定在一个胺类活性反应树脂上解决了这一问题。该试剂盒包含足够的用于蛋白结合和恢复的缓冲液，完成对照试验的高校离心柱和收集管，这些产品进一步缩短了操作实验的时间。重要产品信息：略Co-IP实验步骤：A.抗体固定注意：以下试验步骤是针对用无胺和其他载体蛋白稀释的10-75g亲和纯化抗体（参考重要产品信息一节）。根据实际使用比例参考这一协议步骤。参考重要产品信息节表1中的建议抗体用量和树脂体积用量。1.室温平衡胺连接耦合树脂（AminoLink Plus Coupling Resin）和试剂；2.为每个Co-IP反应准备2ml 1Coupling Buffer（超纯水稀释20Coupling Buffer）；3.轻轻涡旋混匀装有AminoLink Plus Coupling Resin的瓶子，使其处于悬浮状态。使用大口径（或剪掉一段枪头端），添加50l树脂悬液到Pierce提供的离心柱中，将离心柱放入微量离心管中，1000g离心1min，弃滤液；4.添加200l 1Coupling Buffer 清洗树脂2次，离心弃滤液；5.将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除剩余的液体，插上底塞；6.准备10-75g亲和纯化抗体用于结合蛋白，调整体积至200l，使用足够的超纯水和20Coupling Buffer来制备1Coupling Buffer。例如：添加10l 20 Coupling Buffer，180l超纯水和10l浓度为1g/l。可直接添加含有超纯水、20Coupling Buffer、亲和纯化抗体的树脂在离心柱中。7.在通风厨中，每200l反应体系，添加3l氰基硼氢化钠溶液；注：氰基硼氢化钠属剧毒物质，操作时要小心并穿戴防护服。8.拧紧离心柱上螺帽，室温涡旋孵育90-120min，确保浆体在孵育过程中处于悬浮状态；9.握紧底塞，拧开并拿走螺帽，将离心柱置于收集管中离心，保存滤液以便验证抗体耦合；10.打开螺帽，添加200l 1Coupling Buffer，离心弃滤液，重复此步骤1次；11. 向离心柱中添加200l Quenching Buffer，离心弃滤液；12. 将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除残留液体，插上底塞。在树脂上添加200l Quenching Buffer；13. 在通风厨中，添加3l氰基硼氢化钠溶液，拧紧螺帽；轻轻摇动并孵育15min；14.取出底塞，拧开螺帽，将离心柱置于一收集管中，离心弃滤液；15.打开螺帽，采用200l 1Coupling Buffer洗脱树脂，离心。再次重复此步骤；16.用150l Wash Solution洗脱树脂6次，每次洗脱后离心；17.不管是进行细胞裂解、Co-IP，还是储存树脂，都需要继续进行下列步骤；18.用200l 1Coupling Buffer洗脱树脂2次，每次需离心；19. 将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱，去除残留液体，并插入离心柱底部。添加200l 1Coupling Buffer，系上螺帽，将离心柱置于4保存。如果长期储存，需添加sodium azide（叠氮化钠）至终浓度为0.02%。B. 哺乳动物细胞裂解方案I：单层培养细胞的裂解1.小心从细胞中弃掉培养基；2. 采用Modified Dulbeccos PBS（改良型Dulbecco PBS缓冲液）清洗细胞1次；3.向细胞中添加冰冷的IP Lysis/Wash Buffer（表2），冰上孵育5min，期间进行周期性混匀。4.转移溶解物于1个微量离心管中，13000g离心10min ，以便将细胞碎片制成微球；5.转移上层于1个新的离心管用于测定蛋白浓度或进一步的分析实验。方案II：悬浮培养细胞的裂解1.1000g 离心细胞悬液5min，收集细胞团，弃上层；2.用PBS清洗细胞，使细胞团悬浮起来，1000g 离心5min收集细胞；3. 向细胞团中添加冰冷的IP Lysis/Wash Buffer；每50mg湿的细胞团使用500l IP Lysis/Wash Buffer（10：1 v/w）。如果使用大量的细胞，首先向细胞团中加入终体积为10%的IP Lysis/Wash Buffer，移液器上下吹打混匀混合物，再向细胞悬液中加入剩余体积的IP Lysis/Wash Buffer；4.冰上5min，孵育溶解产物，期间周期性摇荡；13000g离心10min去除细胞残渣。转移上清于新的离心管中，用于蛋白质浓度测定或其他分析实验。C. 使用对照组琼脂糖树脂预澄清裂解物5.对于1mg的裂解物，添加80l的对照组琼脂糖树脂（40l的固定树脂）悬浮液到离心柱中；6.离心柱子，以去除存储液；7. 添加100l 1Coupling Buffer于柱中，离心弃掉滤液；8.添加1mg裂解物于含有树脂的离心柱中，4孵育30min-1h;9.1000g 离心柱子1min，弃掉含有树脂的柱子，保存滤液，它们将被添加到已固定化的抗体中，用于Co-IP实验。D. Co-IP所有的Co-IP 实验步骤均在4下完成，除非另有说明。诱饵的数量：如猎物蛋白复合体的要求、孵育时间，这些都依赖于体系的使用、抗体的亲和力、诱饵与猎物的相互作用，而且每个体系必须是最佳化的。此方案使用IP Lysis/Wash Buffer来耦合和洗涤免疫复合体。试剂盒中提供的20Modified Dulbeccos PBS是一个选择性的结合/洗涤缓冲液。使用这种缓冲液3作用于复合物，复合物有可能会被洗涤剂破坏。对于每一个Co-IP反应，需要提前用超纯水稀释2ml 1Modified Dulbeccos PBS；1.如果互作蛋白是分离的，首先混合诱饵蛋白和猎物蛋白，并准备好合理的实验对照组；2.稀释诱饵蛋白：猎物蛋白混合物和对照组使用IP Lysis/Wash Buffer或者其他适当的缓冲液稀释。加入离心柱中的总样品体积建议为100-500l；3.添加200l IP Lysis/Wash Buffer到含有抗体耦合树脂的离心柱中，清洗2次，离心弃滤液；4. 将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱，去除残留液体，并插上底塞；5.添加诱饵蛋白：添加猎物蛋白复合物和对照组至合适的树脂中。拧紧螺帽，4轻轻震荡孵育1-2h，或者过夜；注：优化每一次的结合时间可能是很有必要的。对于大样品体积，建议转移抗体耦合的树脂至一个分开的含有蛋白复合物的离心管中。孵育结束后，通过旋转杯分成0.5ml整数倍进行离心，直到全部样品被处理完。6.移开底塞，松开螺帽，将柱子置于收集管中。离心，保存滤液以备后续实验分析用；7.打开螺帽，将柱子置于一新的离心管中，添加200l IP Lysis/Wash Buffer，离心；8.用200l IP Lysis/Wash Buffer清洗样品至少2次，每次清洗完需离心；注：针对一些特殊的体系，采用A280，SDS-PAGE or Thermo Scientific Micro BCA Protein Assay评价洗脱液的蛋白含量，目的是确定最佳洗脱次数。在Co-IP实验中，最终的洗脱液中应该没有蛋白；对于样品中含有高蛋白浓度的洗脱液，增加洗脱次数或许是非常必要的。E. Co-IP的洗脱注：如果蛋白或者抗体对低pH值比较敏感，使用中性pH值体系（如：Thermo Scientific Gentle Elution Buffer, Product No. 21027）。针对下游酶催化或功能测定实验，应添加1M pH为9.5的Tris 5l到收集管中，这将中和洗脱液的pH值，在基础上在进行离心分离。1.将离心柱放入一新的收集管中，添加10l的洗脱液，离心；2.不要取出柱子，继续向柱子中加入50l洗脱液，室温孵育5min。柱子不需要扣上盖子或者混匀；注：为了获得浓度更高的洗脱产物，可使用少量的洗脱液，但是总产量可能会降低。3.离心收集滤液，分析滤液中的蛋白含量。再次进行D1-D3步骤是非常必要的。从每次离心后的滤液中取出一小部分，分别进行检测分析，以确保抗原完全被洗脱下来。4.为了保持抗体耦合树脂的活性，需即可进行F步骤：树脂的再生与储存。F.树脂的再生与储存1. 添加100l 1Coupling Buffer于柱中，离心弃掉滤液，重复此步骤1次；2.将底塞放回离心柱上，向离心柱中添加200l 1Coupling Buffer，盖上螺帽。用封口膜封住离心管底部，以防止树脂干燥。如果是长期储存（比如大于2周），需添加终浓度为0.02%的叠氮化钠。G.关于SDS-PAGE分析的样品准备1.室温平衡5Lane Marker Sample Buffer，缓慢上下颠倒样品缓冲液5-10次。为缩短凝胶时间，添加1M DTT于5 Sample Buffer中，使终浓度至100mM。2.添加5Sample Buffer至样品中，制成1的终浓度（如：添加5l 5Sample Buffer到 20l的样品中）；3.95-100加热样品5min，在加样前，可将样品置于 室温中冷却。1