微生物大小的测定和显微镜计数微生物大小的测定和显微镜计数 2010级生科一班 201000140027 洪钧烨摘要实验借助特殊的测量工具显微测微尺（包括目镜测微尺和镜台测微尺），在光学显微镜下测量酿酒酵母和枯草杆菌的大小，最终得出两种菌大小的数据。实验利用血细胞计数板对如酵母等微生物单细胞悬液进行计数，最后得到活菌体和死菌体的总数。关键词 显微测微尺 大小 血细胞计数板 目的要求1 学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。2 了解血球计数板的构造、明确其计数原理。3 学习并掌握使用血球计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。基本原理l测微尺的构造： 显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成 目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在 5mm 刻尺上分 50 份。目镜测微尺每格实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。镜台测微尺为一专用的载玻片，中央有精确等分线将长为 1mm 的直线等分成 100 个小格，每格长 10m，专用于校正目镜测微尺。2.球菌用直径表示大小；杆菌用宽和长来表示 图1：测微尺的校正3显微直接计数法：将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或Hawksley计数板。三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。计数区由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则：1mL菌液中的总菌数= 25104B=5104AB （25个中格） = 16104B=3.2104AB（16个中格）实验器材菌种：酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)仪器、材料：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸、香柏油、血球计数板、盖玻片、吸水纸、计数器、无菌滴管等。实验步骤1. 微生物大小的测定。（1）目镜测微尺的安装把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。（2）校正目镜测微尺将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数（图1）。用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下两重合线之间两尺分别所占的格数。 由于已知镜台测微尺每格长10m，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度（m）= （3）菌体大小的测定将镜台测微尺取下，换上细菌染色制片，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。值得注意的是，和动植物一样，同一种群中的不同菌体细胞之间也存在个体差异，因此在测定每一种菌种细胞大小时应对多个细胞进行测量，然后计算取平均值。2. 显微镜计数。（1）无菌生理盐水适当稀释制备酵母菌悬液。（2）镜检血球计数板。（3）加样品。 血球计数板盖上盖玻片，将酵母菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，从计数板平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一滴，利用表面张力沟槽中流出多余的菌悬液。加样后静置5min，使细胞或孢子自然沉降。（4） 将加有样品的血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内有8个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。若有菌体位于格线上，则计数原则为计上不计下，计左不计右。如遇酵母出芽，计数应统一，芽体应全部作为菌体计数或全部不计。（5）清洗。使用完毕后，将血球计数板及盖玻片进行清洗、干燥，放回盒中，以备下次使用。实验结果实验I目镜测微尺校正结果物镜物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表长度（m）低倍镜10高倍镜40油镜100表1-酿酒酵母的大小（所占目镜测微尺原始格数，高倍镜）菌个体项目123平均值长宽表2-枯草芽孢杆菌的大小（所占目镜测微尺原始格数，油镜）菌个体项目123平均值长宽根据公式即可求算出两种菌的大小表3-两种菌的大小菌种项目酿酒酵母枯草芽孢杆菌长（m）宽（m）实验II显微计数结果中格12345平均值个数由公式1ml菌液中的总菌数=中格平均菌数25104稀释倍数得1ml菌液中酵母菌个数为分析 酵母菌的菌体大小很大，长约为 m，宽约为 m，约为枯草芽孢杆菌的 倍。枯草芽孢杆菌长与宽之比约为 ，验证了其“杆”菌的名字。获得的单位体积酵母菌数较同实验室其他组小。可能原因本组酵母菌的培养时间和其他组不同；取菌悬液稀释时，原培养液未摇匀，取了上层液。注意细菌在不同的生长时期细胞大小有时会有较大变化，所取的菌最好处于对数生长期。在测量时，避免将极端大小的菌体纳入数据样本。在测量枯草芽孢杆菌时，由于菌之间有连接，要选取单个的菌体进行测量。清洗血细胞计数板时，勿用刷子等硬物，也不应用酒精灯火焰烘烤计数板。在计数时，每小格内有8个菌体为宜，如果发现菌液太浓或太稀，需重新进行稀释。思考题1 为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？答：因为在不同放大倍数的目镜或物镜下，目镜测微尺每格代表的长度会发生变化。2 在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？答：相同。因为用不同的物镜时都重新校正目镜测微尺，目镜测微尺每格代表的长度可按照重新校正的数据计算。3 哪些因素会造成血球计数板的计数误差，应如何避免？答：器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差；由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差；由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差。前两者可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正；细胞分布误差可通过多次计数取平均值来减小。参考文献1周德庆，微生物教程，高教社第二版2沈萍等，微生物实验教程，高教社第二版1