色 谱 实 验Chromatography江 南 大 学 2 0 0 3 年 3 月目 录色谱实验室注意事项-2实验一 色谱仪器介绍与演示实验-3Introduction of Chromatographic instruments and techniques 实验二 有关色谱参数的测试及计算-4Determination and calculation of GC parameters实验三 保留指数定性实验-7Qualitative analysis (determination of Kovats index)实验四 色谱柱温度对分离度的影响-8Contributing factor for Resolution (Column temperature)实验五 毛细管气相色谱分离白酒中的微量香味化合物-10Separation of trace content of flavor components in distilled spirit by open tubular column实验六 食品中脂肪酸甲酯衍生物的制备和分析-12Preparation and determination of Fatty Acid Methyl Esters(FAME)实验七 毛细管气相色谱法测定风油精中樟脑、薄荷脑和水杨 酸甲酯的含量-13Quantitative analysis of camphor, menthol and salicin acid Methyl Esters in essential balm by open tubular colum实验八 液相色谱测定食品中的维生素A和维生素E-15Determination of Vitamin A and E in dairy product by High Performance Liquid Chromatography实验九 高效液相色谱法测定果汁中糖含糖-17Determination of Saccharide in juice by HPLC色谱实验室注意事项1 实验室必须保持清洁、整齐、安静。2 实验室内严禁烟火。3 实验室内不应有腐蚀性气体、强烈的机械振动和电磁干扰。电机应接地妥当。4 色谱实验室内常用的高压钢瓶颜色(color of gas cylinder)：氧气(O2)天蓝色（blue） 氢气(H2)深 绿 色(green)氮气(N2)黑 色(black) 压缩空气(Air)黑色(black)氩气(Ar)灰 色(gray) 氦气(He)棕 色(brow)5。氧气瓶及其专用工具严禁与油类接触，与明火距离不小于10米。开启高压气瓶时，操作者须站在侧面，严禁敲打气瓶。气瓶的剩余残压一般不小于kg/cm2，决不能用尽。实验一 色谱仪器介绍与演示实验Introduction of Chromatographic instruments and techniques 一、 目的(Objective)熟悉并了解目前色谱领域相关设备如GC、HPLC、GC/MS、HPLC/MS等各各种仪器设备的有关性能、主要特点、操作技能，以及应用范畴，为以后的具体实验操作和科学研究打下基础。二、 要求随着科学的不断发展，色谱技术越来越成熟完善，在理论和方法研究方面日益丰富和深化，仪器和相关配置也日益完善和现代化，应用范围方面更是日益广泛。在当前前沿的学科领域，如生命科学、能源科学、环境保护、有机和无机新型材料，色谱的应用都占有重要的地位。因此要求学生理论联系实际，以强化应用为重点，在学习了色谱的基本理论的基础上，通过参观我校的各种色谱仪器，及实验室技术人员的相关应用方面的介绍和实机演示实验，增强对各种色谱仪的感性认识，并熟悉其应用范围的发展趋势。三、 内容实验前先查阅上述有关设备的相关资料，参观及演示实验的主要机型有气相色谱仪、高压液相色谱、气质联用、液质联用、离子色谱和氨基酸自动分析仪。 实验二 有关色谱参数的测试及计算Determination and calculation of GC parameters一目的(Objective)1通过本实验基本色谱参数的测定与计算，定量地了解溶质组分在色谱柱过程中热力学和动力学作用的量度。2理解各色谱参数的意义及其相互关系。3通过本实验进一步掌握柱效、柱选择性、分离能力、保留值等性质，使之能选择出最佳色谱操作条件，得到可靠的定性、定量结果。二 基本原理(Principle)在规定的色谱条件下，测定惰性组分的死时间（tM）及被测组分的保留时间（tR）、半高峰宽（Wh/2）及峰宽（W）等参数，便可计算出基本色谱参数值。三、仪器与试剂(Equipment and Reagents)1仪器：HP588或岛津GC-14B气相色谱仪，FID或TCD检测器(detector)。2试剂：甲烷(Methane) 、正戊烷(Pentane)、正已烷(Hexane) 、 正庚烷 (Heptane)、乙酸乙酯(Ethyl acetate) 、102白色载体、 二氯甲烷等四实验步骤(Procedure)1联结好仪器系统，检查并调试仪器至正常工作状态。2制备填充色谱柱：（1）Apiezon-L柱：经计算称取适量102白色硅烷载体和Apiezon-L油脂（以15%重量比计），用CH2Cl2将其溶解并均匀地涂渍在载体上，挥发溶剂至干。负压装柱至均匀满口，按老化程序老化好待用。（2）DNP柱：以15%重量比计算称取DNP足量，用乙醚溶解，均匀涂渍在102白色硅烷载体上，挥发溶剂至干，装柱，老化待用。3色谱条件(Gas chromatography unit)：TD=200；TC=60；TV=200；载气(Carrier gas)：N2的压力为54kpa，H2的压力为60kpa，空气压力为45kpa；记录仪灵敏度10mv/25cm；纸速10mm/min；进样量：空气10ul，混合样4ul；信号衰减视灵敏度状况而定。4测定：待仪器开启运行至基线平稳后，取甲烷或空气样品0.1ul注入GC仪器系统，计时，准确记录保留时间（tM）。重复进样至tM值绝大多数重复为止。取其平均值，为本实验的tM（甲烷或空气）值。再取四种混合组分的样品溶液4ul注入仪器系统，得到较理想图谱后，再重复进样几次，取其平均保留时间为本实验各组分的保留时间。五、数据处理(Data and Calculations)1记录甲烷或空气的tM值和四组分混合样的各保留值（平均值）。令tn-1=tR（正戊烷）；tn=tR(正已烷 )；ti=tR（乙酸乙酯）2按GB-4946-85色谱术语标准测量并记录各组分的半高峰宽Wh/2和峰宽W值。3各基本参数计算：（1）调整保留时间：以t，R=tR-tM关系计算出t，n-1、t，n、t，n+1及t，1；（2）相对保留值（ri,s）：按ri,s=t，R（I）/t,R(s)的关系，计算出r正已烷，正戊烷值，r正庚烷，正已烷值（以正戊烷作标准物时）；（3） 容量因子：根据K，=t，R/tM的关系，计算出K，（正戊烷）、K，（正已烷）、K，（正庚烷）、K，（乙酸乙酯）值；（4）理论塔板数：以其中K，=2-5的某组分为代表，根据n=5.54（tR/Wh/2）2或n=16(t，R/W)2的关系计算出柱效率（每米柱效长所具有的理论塔板数）；（5） 有效塔板数：按neff=5.54(t，R/Wh/2)2以及neff=16(t，R/W)2的关系计算出有效塔板数（仍可用K，=2-5的组分）。当K，值足够大时，nneff；（6） 分离度：可根据下列关系，计算出四种组分中较难分离的二组分间的分离度；R=2（tR2-tR1）/(W1+W2)（7）分离数：可根据下列关系，计算出任意相邻正构烷烃峰之间的TZ值（即二峰间可容纳的峰数）。TZ=（tR(Z+1)-t(Z)）/(Wh/2(z)+Wh/2(Z+1)-1六、注意事顼(Hazards,Precautions and Waste Disposal)1色谱基本参数的测定，要严格控制操作条件的稳定，否则易产生误差。2关于tM值的测定：从定义来讲，tM值的测定规定为惰性组分从进样开始至柱后流出浓度极大点所对应的时间，即该惰性组分与固定相发生任何作用（溶解或吸附）便流出色谱柱。实际上不存在这种理想的惰性组分，或多或少在柱中有保留作用，因此直接测量而得到的tM值，相对说不准确，特别是数值小的tM，会引入一定的误差（而数值大的tM误差往往可以略而不计）。因tM值是色谱参数的基准数据，故有许多人研究它的准确计算方法。Peterson用Haferkamp等人所得公式如下： t(n+i)t(n-i)-tn2 tMt(n+i)+t(n-i)-2tn式中，i=1,2,3t(n-i)第一个同系物的保留时间t(正戊烷)tn第二个同系物的保留时间t(正已烷)t(n-i)第三个同系物的保留时间tR(正庚烷)请同学们根据本实验测得的t(n-1)、tn、t(n+1)值，试计算出tM值与甲烷组分实测值的比较值，观其误差。实验三 保留指数定性实验Qualitative analysis (determination of Kovats index)一目的(Objective)1掌握保留指数的概念及测定方法2在没有标样情况下，学会利用文献上保留指数定性。二基本原理(Principle)在一定的色谱条件下，组分的保留指数为一定值，可用下式计算： Ix=100Igx,z/Igz+1,z+Z计算结果与文献值对照即可定性，本实验用此方法定性酯类中的乙酸乙酯。三、仪器与试剂(Equipment and Reagents)1仪器：HP5880或岛津GC-14B气相色谱仪2试剂：正戊烷(Pentane)、正已烷(Hexane)、正庚烷(Heptane)、甲烷(Methane)正辛烷(Octane C8H18)、正壬烷、乙酸乙酯(Ethyl acetate)等四、实验步骤(Procedure)1.实验条件(Conditions)：色谱柱(Column)：300mm4mm不锈钢柱，固定相：SE30；Tc=100，Tv=120，TD=120；Carrier gas:N2流速40ml/m