基础生物学技术试验 实验七：叶绿体色素的提取与纸层析一、 实验目的 、提取叶绿体色素 、对叶绿体色素进行纸层析二、 实验原理纸层析：是层析中最简便的一种。一般的被分离物质在两相中都能溶解的纸层析属于分配层析，它实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，以有机溶剂为流动相，当流动相沿纸经过样品时，样品点上的溶质在水和有机相之间不断进行分配，一部分样品随流动相移动，进入无溶质区，此时又重新分配，一部分溶质由流动相进入固定相（水相）。随着流动相的不断移动，各种不同的部分按其各自的分配系数不断进行分配，并沿着流动相移动，从而使物质得到分离和提纯。当层析溶剂不断从纸上流过时,由于混合物(叶绿素提取液)中各种成分在固定相和流动相间溶解度和吸附能力不同而具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后,可将各种色素分开。叶绿体色素的提取、分离实验原理：植物叶绿体色素是吸收太阳光能,进行光合作用的重要物质.它一般由叶绿素a,叶绿素b,胡萝卜素和叶黄素组成，它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体。绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）这两类色素都很难溶于水，而易溶于有机溶剂,故可用乙醇,丙酮等有机溶剂提取。 三、 实验器材菠菜或青菜叶片.仪器设备研钵，漏斗，冻存管，剪刀，滴管, 滤纸，脱脂棉（或尼龙布或纱布），毛细管，吸水纸。药品试剂：无水乙醇和丙酮；石英砂；碳酸钙；层析液：石油醚10ml+丙酮2ml+苯1ml.四、 实验步骤1.叶绿体色素的提取(1)取植物新鲜叶片2 g,洗净,擦干,去掉粗的叶脉，剪碎,放入研钵中；(2)研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉, 研磨至近乎糊状，加入10-15mL 无水乙醇,再研磨片刻，提取3-5 min，然后用漏斗（内放一层薄的脱脂棉）过滤,即得色素提取液。2.叶绿体色素的分离(1)制备滤纸条：剪去一端两角，在距离剪角一端1 1.5 cm处用铅笔画线（或简单做个记号）。(2) 画滤液细线：用毛细吸管吸收少量滤液，沿铅笔线（记号）处均匀地画一条直的滤液细线。干燥后，连续重复35次，至滤液细线呈绿色。(3)分离色素：倒入层析冻存管23 ml层析液，适当调节层析液液面，以放入滤纸条后样品线至少稍稍高出滤液为宜。以将滤纸条尖端朝下略微斜靠烧杯内壁，轻轻插入层析液，旋紧盖子3.（1）取圆形定性滤纸一张（直径11cm），在其中心戳一圆形小孔（直径约3mm）。另取一张滤纸条（5cm1.5cm），用毛细管吸取叶绿体色素提取液沿纸条的长度方向涂在纸条的一边，使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，再重复操作数次，然后沿长度方向卷成纸捻，使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。（2）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿凸出）。（3）在9cm培养皿内放一3cm培养皿，在3cm培养皿中央小室中加入适量的推动剂，把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿。此时，推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。所用培养皿底、盖直径应相同，且略小于滤纸直径，以便将滤纸架在培养皿边缘上。（4）当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素，用铅笔标出各种色素的位置和名称。五、 实验结果六、 实验结论当推动剂前沿接近滤纸上端边缘时，取出滤纸，自然晾干，观察色带的分布：四种色素在滤纸上的移动速度是胡萝卜素(橙黄色)叶黄素(黄色)叶绿素a(蓝绿色)叶绿素b(黄绿色)。七、 实验注意事项1、材时要选取新鲜的颜色较深的叶片，是因为以便使滤液中含较多的色素；2、研磨时加入石英砂的目的是为了研磨得充分，更有效地破坏细胞结构；但由于二氧化硅粉是特别细的白色粉末，再加上控制不好用量，易过量，使滤液中含有较多的二氧化硅，而导致滤液颜色变浅。滤液中杂质越多，实验现象越不明显。不要加太多！3、入少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素受到破坏。因为叶绿体分子结构中含有一个镁原子，当细胞破裂时，细胞液内有机酸中的氢可取代镁原子而成为褐色的去镁叶绿素，碳酸钙可中和有机酸以防止去镁反应的发生。4、研磨要迅速、充分。这是因为一是因为提取液容易挥发；二是为了使叶绿体完全破裂，从而能提取较多的色素；三是叶绿素极不稳定，能被活细胞中的叶绿素酶水解而破坏。迅速和充分是存在着一定冲突的两种要求，在实验中，可采用先不加提取液，研磨几分钟后再加入提取液。5、制备滤纸条时，根据边缘扩散原理，物质分子沿边缘扩散速度要大于里边扩散的速度，因此要将滤纸条的一端剪去两角，主要是为了延长边缘长度，这样可以使色素在滤纸条上扩散均匀，便于观察实验结果。6、画线时，一定要细并且直，这样可以防止色素带重叠，使色素分子均匀分布在一条直线上，做到扩散起点一致。重复划2-3次，是为了增加滤液细线上的色素分子数量，使实验效果更加明显。7、分离色素时，一定不要让滤纸条上的滤液细线没及到层析液，这是因为色素易溶解于层析液中，导致色素带不清晰，影响实验效果。分离色素用的圆形滤纸，在中心打的小圆孔，周围必须整齐，否则分离的色素不是一个同心圆八、 问题与解答1、 滤液细线为什么要画直，要画几次？答：就是为了防止色素带的重叠；增加色素量，使色素带的颜色更深一些。2、为什么要在研磨时加碳酸钙和二氧化硅？答：加二氧化硅是为了充分研磨，加碳酸钙是为了保护叶绿体色素。1