高通量原位杂交新技术及其在HER 2基因CISH法检测中的应用摘要 目的：创立一种高通量原位杂交技术以提高检测效率和减少试剂用量， 以解决当前原位杂交技术临床应用费用高通量低的痛点。方法：将待检组织细胞 样品制备成薄膜载片放入微孔板中，在定制的微孔板杂交仪中完成杂交反应。结 果：通过对乳腺癌和肺癌HER 2基因的检测证实了该方法经济高效结果可靠。结 论：采用薄膜载片微孔板检测系统进行高通量原位杂交可以将12个载玻片的杂 交仪的检测通量提高至19 2个，同时单个样本节省8 0%的试剂用量。原位杂交技术（in situ hybridization, ISH）在生命科学领域应用广泛，尤其在药物 靶点检测和遗传病诊断等方面具有重要的应用价值，被公认为靶向治疗基因靶点 检测的金标准。但由于原位杂交所用的分子探针价格昂贵和现有原位杂交仪检测 通量低，并且操作步骤繁杂，临床上往往并不作为药物靶点检测的首选方法。为 此，我们研发了高通量的原位杂交检测系统，在提高检测效率的同时降低了检测 成本，并在肿瘤组织HER 2基因靶点的检测中得到了验证。用于肿瘤组织药物靶点检测的原位杂交技术，根据其信号发生原理的不同，目前 主要分为荧光原位杂交（FISH），显色原位杂交（CISH）和银染原位杂交（SISH） 三种。以HER2基因靶点检测为例，FISH法HER2检测临床已应用多年，积累了比 较多的案例和数据，检测结果准确性高和重复性好，故被确定为金标准。为了验 证我们高通量原位杂交技术的实际效果，我们选用经过FISH法检测过HER 2基因 靶点的乳腺癌和肺癌病理样本79例，采用薄膜载片微孔板高通量技术通过CISH 法复检上述肿瘤组织HER 2基因的扩增情况，以检验本系统的实际应用效果。现 将高通量原位杂交新技术及其检测结果报告如下。1 .材料与方法1 .1实验材料 选择浙江省宁波市第六人民医院病理科经过 FISH 法检查过的乳 腺癌和肺癌石蜡病理组织块，用透明耐高温的塑料薄膜作为组织切片的载体，捞 片之后脱蜡水化， HE 染色后镜下选取乳腺浸润性导管癌患者肿瘤细胞浸润部位进 行标记，然后用特制的打孔器取下被标记的圆形组织片，放入定制的多孔板中。1.2实验方法 仪器和试剂 1）HER2/CEN17双显色分子探针购自Zy to Vision GmbH公司，与HER 2基因杂交最后显深绿色，与CEN 17杂交的显浅红色。2）高通量原位杂交仪由宁波吉聚生物科技有限公司生产。 观察实验结果所用的光学显微镜型号为OlympusCX31。1.3实验步骤 杂交前：1）薄膜组织切片的制备：选用耐高温不变形的塑料薄 膜作为组织切片的载体，捞片后进行烤片70Cx10min; 2）脱蜡和水化：组织切片 依次放入二甲苯（xylene2x5min）和梯度酒精（100%乙醇x5min, 90 %2x5min,70%2x5min;）。3）过氧化氢灭活内源性酶3%H2O2x5min; 4）蒸馏水洗3 遍；5） EDTA杂交前处理液x15min； 6）立即蒸馏水洗3遍。7）加胃蛋白酶消化 液于组织切片上，室温中3-10 min （保湿条件）；8）蒸馏水洗3遍；9） 70%， 90%和100%乙醇X1min；空气中晾干。杂交过程1） Vortex （混悬震荡）探针 工作液，加5微升原位杂交探针工作液于癌组织切片上，充分覆盖组织，避免气 泡； 杂交过程：置高通量原位杂交仪上微孔板中，设置80CX5min 37CX12小 时过夜；杂交后：1）次日备2缸SSC冲洗液，其中1缸预热至80C，先用室 温SSC冲洗液，再用预热SSC冲洗液浸泡组织杂交片5mi n；2 ）蒸馏水洗2x1min；3 ） 1x TBS缓冲液（0.025%Twee n20 / PBS）洗3遍；封闭液封闭组织杂交片1 0 mi n; 4 ）滴加鼠抗地高辛DIG/兔抗DNP抗体（一抗）工作液1 0微升 /片，37Cx30min或室温60min；5） TBS洗3遍；6）滴加HRP/AP标记的抗鼠和抗兔抗体（二抗）混合工作液37Cx15min或室温30 mi n；7 ）孵化期间将 AP-Red A（30 微升） 和 AP-Red B（970 微升）混合（避免强光）待用；8） TBS3x1min冲洗；9 ） AP-Red混合液室温10min;1 0）孵化期间将HRP- GreenA（40 微升） 和 HRP- GreenB （960 微升）混合（避免强光）待用； 11 ） 蒸 馏水洗2x1min； 1 2 ） HRP-Green混合液切片上室温10min； 1 3 ）蒸馏水洗2x1min； 16）核绿（Nuclear Blue）染液 2min； 1 4 ）流水洗 2min; 15）封片；1 6）光镜 下观察计数。检测结果判断标准：选择细胞核大小一致无重叠，且边界完整信号清晰的浸润癌 细胞进行计数，随机计数30个浸润癌细胞核的双色信号，其中绿色信号代表 HER 2基因，红色信号代表CEN17 ；计算这些细胞核中绿色信号之和与红色信 号之和的比值，若比值大于2则结果为阳性，表明肿瘤组织HER 2基因扩增；若 比值小于2但平均每个癌细胞HER 2绿色信号计数大于/等于6亦为阳性。若绿色信号之和与红色信号之和的比值小于2且平均癌细胞HER 2绿色信号数小 于2则为阴性，表明组织细胞没有HER 2基因的扩增；若比值小于2,平均癌细 胞HER 2绿色信号数介于4 6之间，则需另外计数30个浸润癌细胞重新进行 统计。然后对结果进行最终判断。结果和讨论结果:在 50 例 FISH 法 HER2 检测阳性的肿瘤组织标本中,经高通量 CISH 法复检发 现有49例CISH呈现HER2基因高倍扩增，仅1例显示无扩增；CISH法与FISH法在 HER2 基因扩增的检测上符合率为 98%。另 29 例 FISH 检测 HER2 表达为阴性的标 本中，经高通量 CISH 复检 HER2 基因扩增情况与 FISH 符合率为 100%。高通量 CISH 与 FISH 的总体符合率为 98.7%,与国外文献报道（1.2）， CISH 与 FISH 的检测 结果的整体符合率为 96%的结果相近似, 可见高通量 CISH 法是检测 HER2 基因扩 增的一项实用可靠的新技术。二者明显相关（P0.001）。结论:采用高通量原位杂交 仪进行 CISH 法检测乳腺癌 HER2 基因扩增的结果与 FISH 法检测的结果符合率高度 一致。与以往的检测方法相比，高通量原位杂交检测技术单次检测通量增加 16 倍，单个样品分子探针的用量减少 80%以上。大大降低了检测成本并提高了检测 效率。可作为乳腺癌 HER2 基因检测的一项新技术;但在具体操作时,应注意严格控 制切片厚度、消化时间及杂交后洗涤温度与时间等因素。讨论：由于妇女乳腺癌的发病率居高不下，且有逐年增长的趋势，精确检测肿瘤 细胞HER 2基因状态对于患者的精准治疗和预后判断十分必要，因此美国病理医 师协会建议所有乳腺癌患者均需检测HER 2靶点，目前HER 2蛋白靶点的检测主 要通过免疫组化染色（IHC）来完成，HER 2基因靶点的检测主要通过荧光原位杂 交（FISH）来判定，前者成本低，但假阳性和假阴性高，适合于病患的初筛；而 后者成本高，准确性也比较高，故成为HER 2靶点检测的金标准，但病理样本的 荧光染色不能长期保存。 CISH 技术具有敏感准确，重复性好，样本可长期保存， 成本介于 IHC 和 FISH 法之间等诸多优点（3.4.5.6.7），未来有望替代 IHC 和 FISH 法成为HER 2检测的首选，更由于采用原创性的高通量薄膜载片多孔板检测系统, 每张病理样品的分子探针用量节省 50%以上，在研究中我们注意到，由于我们使 用的是显色双染 CISH 探针同时观察红色和绿色信号，绿色的 HER2 信号可能覆盖 红色的着丝粒信号，或者出现相反的情况，都会导致 HER2 计数偏多或偏少的情 况，导致HER2检测假阳性或假阴性的可能。扩增程度越高，HER2/CEN17的比值 偏差越大。由于FISH是在油镜下观察(100倍)，信号点会比CISH的40倍或60 倍更大、更清晰和容易观察。并且， FISH 可用不同滤片观察不同颜色，信号不易 被遮挡，因此计数会更加准确，特别是不同颜色的信号重叠时。因此在临界比值 样本中，CISH由于信号重叠，可能会有较大的比值偏差，需要用FISH进一步确认。 临床实践表明对 CISH 计数的技术人员要求更高，已经熟悉 FISH 计数的技术人员 还需进行进一步培训才能胜任CISH计数的工作，需要掌握明场视野下的组织学知 识才能识别肿瘤细胞，完成 CISH 计数。这也是 CISH 相对 FISH 比值低的一个原因。 操作过程中应严格控制切片厚度和酶的消化时间，一般要求切片厚度为45ym，酶 的消化时间控制在5 分钟;切片越厚消化时间越长。杂交变性要彻底,杂交后的洗 涤温度和时间也很重要，最好控制在7075C;每次实验最好有阳性对照片，可以有 效进行质量控制。1F.E. Rosa, R.M. Santos, S.R. Rogatto, and M.A.C. Domingues Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carci nomas. 2013 Mar; 46(3): 207-216. Braz J Med Biol Res.2. Lambros MB, Natrajan R, Reis-Filho JS. Chromogenic and fluorescent in situ hybridization in breast cancer. Hum Pathol. 2007;38:1105-1122.3. Lambros MB, Natrajan R, Reis-Filho JS. Chromogenic and fluorescent in situ hybridization in breast cancer. Hum Pathol 2007; 38: 1105-1122.4. Zhao J, Wu R, Au A, Marquez A, Yu Y, Shi Z. Determinationof HER2 gene amplification by chromogenic in situ hybridization (CISH) in archival breast carcinoma. Mod Pathol 2002; 15: 657-665.5. Tanner M, Gancberg D, Di Leo A, Larsimont D, Rouas G, Piccart MJ, et al. Chromogenic in situ hybridization: a practical alternative for fluorescence in situ hybridization to detect HER-2/neu oncogene amplification in archival breast cancer samples. Am J Pathol 2000; 157: 1467-1472.6. Arnould L, Denoux Y, MacGrogan G, Penault-Llorca F, Fiche M, Treilleux I, et al. Agreement between chromogenic in situ hybridisation (CISH) and FISH in the determination of HER2 status in breast ca